甲状腺结节是一种临床常见病,大多数为良性,仅5% ~ 17%为恶性,高频超声是甲状腺结节检查的首选方法[1]。WHO将甲状腺肿瘤最大径线≤10 mm的甲状腺乳头状癌定义为甲状腺微小乳头状癌（PTMC）。近年PTMC的检出率有所增加,可能与高分辨率超声技术发展和细针穿刺技术广泛应用有关[2]。大部分PTMC侵袭能力较低,但有一小部分PTMC侵袭性较强,易出现颈部淋巴结转移和复发[3,4]。BRAFV600E基因突变作为甲状腺乳头状癌最常见的基因变异形式,与甲状腺外侵犯、淋巴结或远处转移、肿瘤进展或复发密切相关[5,6]。有学者建议对于高风险PTMC患者采取手术治疗,低风险的PTMC患者则可选择手术或积极观察[7]。对于甲状腺微小结节患者尤其PTMC患者,如何既能减少过度治疗,又尽可能地保护患者甲状腺功能是我们需要面临的问题。本研究旨在探讨细针穿刺细胞学检查（FNAB）联合BRAFV600E基因突变检测对提高甲状腺微小结节良恶性鉴别诊断准确性的意义,现报告如下。
对象与方法
一、研究对象
收集2016年6月至2018年1月因甲状腺结节具有可疑恶性超声征象而在我院进行甲状腺穿刺的85例患者共85个结节。本研究经医院伦理委员会批准,所有患者在穿刺术前均已签署知情同意书。病例入选标准：年龄16岁 ~ 80岁,甲状腺结节最大径线≤10 mm,常规超声检查提示结节有恶性超声图像特征（实性结节,低回声,微小钙化,边缘不清晰,纵横比大于1）。多发可疑结节者,选取其恶性可能最大者入组。排除纯囊性结节、细针穿刺术前凝血功能异常者、术前未停服阿司匹林等抗凝药品或停药时间未达标准者。
二、方 法
1. 超声检查
选用PHILIPS iU22彩色多普勒超声（彩超）系统（探头频率6.0 ~ 10.0 MHz）,首先观察甲状腺结节的大小、边界、形态、结节内血流信号、内部回声、钙化类型等,然后观察病灶内部及周边的血流及分布情况。
2. FNAB
患者取仰卧位,充分暴露颈部,超声介入医师常规超声观察病灶情况后,确认穿刺路径,常规碘伏消毒,铺无菌巾,在超声实时观察针尖活动情况,拔出针芯形成负压,然后在不同针道反复提插数次后拔出穿刺针,用充满空气的5 ml注射器将细针内的细胞推注于载玻片,实时涂片。FNAB均由具有5年以上穿刺经验的超声医师完成,所有送检涂片由具有5年以上甲状腺细胞病理学诊断经验的病理科医师进行诊断。依据Bethesda标准,细胞学诊断结果分为6级：Ⅰ级,标本无法诊断或不满意;Ⅱ级,良性;Ⅲ级,意义不明确的非典型性病变或意义不明确的滤泡性病变（AUS/FLUS）;Ⅳ级,滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤（FN）;Ⅴ级,可疑恶性肿瘤（SUSP）;Ⅵ级,恶性肿瘤[8,9]。
3. BRAFV600E基因突变检测
在细胞学涂片完成后,将连接5 ml注射器的穿刺针置于盛有BRAFV600E基因突变检测试剂（厦门艾德）的EP管中反复冲洗。取每例患者的穿刺后冲洗液,采用DNA提取试剂盒法提取穿刺结节的冲洗液DNA,通过荧光定量PCR实验得到突变信号或内控信号的Ct值,根据Ct值判断是否发生突变。若样本突变信号Ct值≥28为阴性,样本突变信号Ct值< 28为阳性。FNAB细胞学结果以Bethesda Ⅴ、Ⅵ级为诊断甲状腺癌的标准,BRAFV600E突变阳性为诊断甲状腺癌的标准。
4. FNAB联合BRAFV600E检测
以BethesdaⅤ、Ⅵ级或BRAFV600E突变阳性为标准诊断甲状腺癌,所有细胞学结果及BRAFV-600E基因突变检测结果均与术后病理诊断对照。
三、统计学处理
使用SPSS 21.0处理数据。采用诊断性试验评价FNAB、BRAFV600E基因突变、FNAB联合BRAFV600E基因突变检测对鉴别甲状腺微小结节良恶性的价值,受试者工作特征（ROC）曲线评估其诊断效能,MedCalc 19.0比较3种方法的ROC曲线下面积（AUC）。采用配对$\chi^{2}$检验FNAB、BRAFV600E基因突变、FNAB联合BRAFV600E基因突变3种方法鉴别诊断甲状腺微小结节良恶性的灵敏度、特异度和诊断符合率。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、手术病理结果
71例甲状腺结节均行手术切除,术后病理结果：恶性48例,均为PTMC;良性23例,其中甲状腺腺瘤5例、桥本甲状腺炎1例、结节性甲状腺肿17例（其中6例局部滤泡上皮异型增生）。
二、FNAB和BRAFV600E基因突变检测结果
FNAB中,标本无法诊断或不满意共5例（其中1例BRAFV600E基因突变阳性）、良性13例（其中2例BRAFV600E基因突变阳性）、AUS/FLUS共8例（其中3例BRAFV600E基因突变阳性）、FN共6例（其中3例BRAFV600E基因突变阳性）、SUSP共9例（其中4例BRAFV600E基因突变阳性）、恶性肿瘤30例（其中27例BRAFV600E基因突变阳性）,见表1。FNAB、BRAFV600E基因突变、FNAB联合BRAFV600E基因突变3种方法术前诊断PTMC的灵敏度、特异度、诊断符合率见表2。FNAB诊断PTMC的ROC AUC为0.842（95%CI 0.743 ~ 0.940）,BRAFV600E基因突变术前诊断PTMC的ROC AUC为0.820（95%CI 0.713 ~ 0.927）,FNAB联合BRAFV600E基因突变术前诊断PTMC ROC AUC为0.860 （95%CI0.752 ~ 0.968）,见图1。FNAB联合BRAFV600E基因突变检测术前诊断PTMC的灵敏度（90%）高于单独应用FNAB或BRAFV600E基因突变（均为$\chi^{2}$= 4.170,P = 0.041）。3种方法术前鉴别诊断甲状腺微小结节良恶性的特异度、诊断符合率和ROC AUC比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。
表1 FNAB及BRAFV600E基因突变检测和术后病理结果 例 |
| FNAB细胞学结果 | BRAFV600E突变阴性 | BRAFV600E突变阳性 | 合计 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 手术良性 | 手术恶性 | 手术良性 | 手术恶性 | ||
| Ⅰ | 3 | 1 | 0 | 1 | 5 |
| Ⅱ | 9 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| Ⅲ | 4 | 1 | 1 | 2 | 8 |
| Ⅳ | 2 | 1 | 2 | 1 | 6 |
| Ⅴ | 2 | 3 | 0 | 4 | 9 |
| Ⅵ | 0 | 3 | 0 | 27 | 30 |
| 合计 | 20 | 11 | 3 | 37 | 71 |
表 2 3种方法术前鉴别诊断甲状腺微小结节良恶性的效能比较 |
| 检测方法 | 结果 | 手术病理结果（例） | 灵敏度 | 特异度 | 诊断符合率 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 恶性 | 良性 | |||||
| FNAB | 阳性 | 37 | 2 | 77% | 91% | 82% |
| 阴性 | 11 | 21 | ||||
| BRAFV600E | 阳性 | 37 | 3 | 77% | 87% | 80% |
| 阴性 | 11 | 20 | ||||
| FNAB+ BRAFV600E | 阳性 | 43 | 5 | 90% | 78% | 85% |
| 阴性 | 5 | 18 | ||||
讨 论
BRAFV600E基因突变与甲状腺癌的侵袭性有关[17]。BRAFV600E基因突变率为29% ~ 83%[18]。另有研究显示,BRAFV600E基因突变可见于77%的进展期PTMC及32%无进展期PTMC[2]。本研究显示,BRAFV600E基因突变阳性率为56%,与既往报道相符。本研究中,FNAB联合BRAFV600E基因突变检测术前诊断PTMC的灵敏度90%、特异度78%、诊断符合率85%,其灵敏度高于单独应用FNAB或BRAFV600E基因突变检测。FNAB联合BRAFV600E基因突变检测可以提高部分PTMC术前的诊断率。在5例细胞学诊断结果为无法诊断或不满意、8例细胞学诊断结果为AUS/FLUS、6例细胞学诊断结果为FN中分别检出1例、3例、3例BRAFV600E基因突变阳性,经术后病理证实分别有1例、2例、1例PTMC。结果提示,在FNAB无法诊断或不满意、AUS/FLUS、FN细胞诊断结果的患者中,联合应用BRAFV600E基因突变检测可减少PTMC的漏诊。
综上所述,FNAB联合BRAFV600E基因突变检测可以提高术前鉴别诊断甲状腺微小结节良恶性的灵敏度,在患者经济条件允许的前提下,尤其当FNAB细胞学检查结果无法明确甲状腺结节性质的情况下,可考虑联合BRAFV600E基因突变检测,以提高PTMC诊断的准确性。但本研究样本量较少,可能导致研究结果的偏倚,这有待日后加大样本量进一步验证。