肾细胞癌起源于肾脏表皮,90%的肾癌都属于肾细胞癌。这种恶性肿瘤包括了超过10种组织和分子亚型,对后续的诊断和治疗都造成了很大的困扰。肾透明细胞癌是肾细胞癌中最常见的类型,接近75%的肾细胞癌都是肾透明细胞癌,而且也是致死率最高的肾细胞癌种类[1]。虽然肾细胞癌的临床治疗研究在近年已经取得了很大的进步,但是肾细胞癌的自然病史和预后都呈现多样性,有的发展缓慢,有的可表现出高度的侵袭性[2]。临床医师需要通过早期诊断为患者提供最佳的个体化治疗方案,所以寻找特异度高、灵敏度强的分子生物学指标势在必行。这既可以避免众多医疗资源的浪费,又可以客观评估肿瘤的潜在转移侵袭性和预后,对于肾透明细胞癌的个体化治疗有着重要的意义[3]。
甘油三磷酸脱氢酶1样抗原（GPD1L）的编码蛋白是一种蛋白酶,催化甘油三磷酸转变为磷酸甘油酮。GPD1L编码蛋白存在于与质膜相关的细胞质中,在该处结合钠通道、电压门控、V型、α亚单位（SCN5a）。该基因的缺陷可导致布鲁加达综合征2型（BRS2）和婴儿猝死综合征（SIDS）[4]。近年来,非编码RNA尤其是微小RNA（miR）和肿瘤之间的研究发展迅速,多项研究显示miR-210可以靶向抑制GPD1L从而促进了肿瘤在缺氧环境中的生长,而同时miR-210又是缺氧诱导因子-1（HIF-1）的下游靶点,在多种肿瘤生长发展中起着重要作用[5]。业已证实,GPD1L在头颈癌、肝细胞癌等肿瘤中扮演重要角色[6,7]。但是,GPD1L在肾细胞癌尤其是透明细胞癌中的作用还没有相关的文章报道。组织芯片是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载体上,这样可以在同一实验条件下进行同一指标的组织学研究,一次性实验即可获得大量的结果。癌症基因组图谱（TCGA）公共数据库是通过采用高通量基因组测序、基因芯片运用多维数据整合分析方法将几乎人类所有恶性肿瘤基因表达水平图谱绘制出来的数据库,通过对TCGA数据库的研究可以为恶性肿瘤的诊断、分类标准和治疗方法提供新的策略。本次采用的组织芯片包括79例肾透明细胞癌样本及10例正常肾脏组织样本,并利用TCGA中肾透明细胞癌的mRNA数据库进行临床数据分析,旨在研究GPD1L在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义。
材料与方法
一、材 料
组织芯片购自西安艾丽娜生物科技有限公司（BC07115a）。每张芯片包含79例肾透明细胞癌标本和10例正常肾脏组织标本,所有病例均为接受肾癌切除手术治疗,手术前均未接受放射治疗或化学治疗。所有标本均经过HE染色并由病理科医师明确诊断。每例标本均附有相关临床数据,如年龄、性别、病理分级、肿瘤分期,见表1。
表1 组织芯片及TCGA的临床资料[例（%）] |
| 临床特征 | 组织芯片（79例） | TCGA（530例） |
|---|---|---|
| 年龄 ≤65岁 | 48（61） | 348（66） |
| >65岁 | 31（39） | 182（34） |
| 性别 男 | 59（75） | 186（36） |
| 女 | 20（25） | 344（34） |
| 福尔曼病理分级 1 ~ 2级 | 63（80） | 322（61） |
| 3 ~ 4级 | 16（20） | 208（39） |
| 临床分期 Ⅰ~Ⅱ期 | 56（71） | 340（64） |
| Ⅲ~Ⅳ期 | 23（29） | 190（36） |
| 转移 M0 | 53（67） | 420（79） |
| M1 | 26（33） | 110（21） |
二、数据下载
TCGA肾透明细胞癌数据库是一个包含553例肾透明细胞癌组织及对应癌旁肾脏正常组织的大样本基因测序库,本研究纳入其中有GDP1L基因检测结果及详细临床资料的530例肾透明细胞癌及对应癌旁肾脏正常组织进行分析,具体的临床信息和分子特征来源于TCGA网站（http:// cancergenome.nih.gov/）,见表1。
三、GPD1L蛋白表达强度检测
使用迈新生物技术UltraSensitiveTM SP IHC 试剂盒对组织芯片进行免疫组织化学染色（免疫组化）,60 ℃烘烤组织芯片40 min,使用二甲苯、无水酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精梯度脱蜡,过氧化氢溶液封闭15 min,减低内源性过氧化物酶活性,之后使用0. 01 mmol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复,待组织芯片自然冷却至室温,血清封闭。一抗GPD1L（1:100,爱博泰克生物,货号A14392）4 ℃孵育过夜,二抗室温孵育60 min,三抗室温孵育15 min,二氨联苯胺试剂盒显色,苏木素复染细胞核。免疫组化评分由两位病理专科医师独立完成,芯片染色结果根据着色强度和着色范围进行评估。染色强度根据镜下所见的肾小管上皮细胞的颜色深度分为0、1、2、3共4个等级,染色范围分为0（无着色）、1 （0% ~ 10%）、2 （10% ~ 50%）、3（51% ~ 75%）、4（76% ~ 100%）共5个等级,最终得分为染色强度与染色范围的乘积。
四、研究方法
观察组织芯片中肾脏正常组织与肾透明细胞癌组织GPD1L蛋白的表达部位及表达强度,分析TCGA中肾透明细胞癌组织与对应癌旁肾脏正常组织GPD1L基因的表达水平差异。按基因芯片中肾透明细胞癌GPD1L蛋白表达强度分为高表达（免疫组化得分> 6分）组与低表达（免疫组化得分 ≤6分）组,按TCGA中肾透明细胞癌GDP1L mRNA表达水平分为高表达（mRNA表达水平>均值）组与低表达（mRNA表达水平≤均值）组,分析肾透明细胞癌患者GDP1L表达与临床特征的关系。观察TCGA中肾透明细胞癌患者的预后,使用总体生存期（OS）作为研究的终点,OS是指从确诊肾透明细胞癌至患者死亡或最后一次随访之间的时间,绘制肾透明细胞癌患者的生存曲线,分析GDP1L对预测肾透明细胞癌患者预后的意义。
五、统计学处理
使用SPSS 24.0处理数据。计量资料以$\bar{x} \pm s$表示,组间比较采用t检验。计数资料以例（%） 表示,组间比较采用x2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。应用单因素和多因素Cox比例风险回归分析肾透明细胞癌患者预后的影响因素。P < 0.05表明差异有统计学意义。
结 果
一、组织芯片中肾透明细胞癌GPD1L蛋白的表达部位及表达强度分析
二、组织芯片中肾透明细胞癌GPD1L蛋白表达强度与肾透明细胞癌患者临床特征的分析
肾透明细胞癌组织芯片中,GPD1L高表达23例、低表达56例。低表达组中病理分级高和临床分期晚者比例高于高表达组（P均< 0.05）,见表2。
表2 肾透明细胞癌患者中GPD1L与临床特征间的关系[例（%）] |
| 临床特征 | GPD1L蛋白（组织芯片） | GPD1L mRNA（TCGA） | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 低表达 （56例） | 高表达 （23例） | 2值 | P值 | 低表达 （265例） | 高表达 （265例） | 2值 | P值 | |
| 年龄 ≤65岁 | 38（68） | 17（74） | 0.283 | 0.595 | 166（63） | 182（69） | 2.142 | 0.143 |
| >65岁 | 18（32） | 6（26） | 99（37） | 83（31） | ||||
| 性别 男 | 43（77） | 16（70） | 0.450 | 0.503 | 80（30） | 107（60） | 6.024 | 0.014 |
| 女 | 13（23） | 7（30） | 185（70） | 158（60） | ||||
| 福尔曼病理分级 1~2级 | 34（61） | 22（96） | 9.642 | 0.002 | 130（49） | 192（72） | 29.074 | < 0.001 |
| 3~4级 | 22（39） | 1（4） | 135（51） | 73（28） | ||||
| 临床分期 Ⅰ~Ⅱ期 | 37（66） | 21（91） | 5.319 | 0.021 | 142（54） | 198（75） | 25.729 | < 0.001 |
| Ⅲ~Ⅳ期 | 19（34） | 2（9） | 123（46） | 67（25） | ||||
| 转移 M0 | 35（63） | 18（78） | 1.834 | 0.176 | 211（80） | 241（91） | 13.530 | < 0.001 |
| M1 | 21（38） | 5（22） | 54（20） | 24（9） | ||||
| 死亡 否 | - | - | - | - | 158（60） | 199（75） | 14.425 | < 0.001 |
| 是 | - | - | 107（40） | 66（25） | ||||
注:-无数据 |
三、TCGA中GPD1L mRNA表达水平与肾透明细胞癌患者临床特征及预后的分析
四、TCGA中影响肾透明细胞癌患者OS的单因素及多因素分析
对TCGA肾透明细胞癌患者的单因素分析显示,GPD1L mRNA低表达、年龄大、临床分期晚、病理分级高、出现转移者OS较短（P均< 0.05）;多因素分析显示,GPD1L mRNA表达水平、年龄、肿瘤转移是肾透明细胞癌患者OS的影响因素（P均< 0.05）,见表3。
表3 TCGA中影响肾透明细胞癌患者OS的Cox回归分析 |
| 参 数 | 单因素分析 | 多因素分析 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| HR | 95%CI | P值 | HR | 95%CI | P值 | |
| GPD1L mRNA表达水平 | 0.490 | 0.338 ~ 0.710 | < 0.001 | 0.722 | 0.468 ~ 1.115 | 0.042 |
| 年龄 | 1.997 | 1.371 ~ 2.911 | < 0.001 | 2.502 | 1.605 ~ 3.902 | < 0.001 |
| 性别 | 0.918 | 0.628 ~ 1.341 | 0.657 | 0.862 | 0.551 ~ 1.349 | 0.516 |
| 临床分期 | 4.567 | 3.098 ~ 6.731 | < 0.001 | 0.897 | 0.263 ~ 3.055 | 0.861 |
| 病理分级 | 5.941 | 3.992 ~ 8.840 | < 0.001 | 3.143 | 0.876 ~ 11.276 | 0.079 |
| 转移 | 13.058 | 7.147 ~ 23.857 | < 0.001 | 7.552 | 3.695 ~ 15.433 | < 0.001 |
讨 论
GPD1L是编码催化甘油三磷酸转变为磷酸甘油酮的关键酶。已经有报道GPD1L作为miR-210的直接靶点,在肿瘤形成缺氧环境过程中发挥着重要作用,并已在肝癌、头颈癌等有相关的研究[10]。目前,GPD1L在肾细胞癌尤其是肾透明细胞癌中的作用尚缺乏相关的研究。本研究中,与肾脏正常组织相比,GPD1L在肾透明细胞癌组织中的蛋白水平下降,这表明GPD1L可能抑制了肾透明细胞癌的发生和发展。此外,GPD1L蛋白的低表达与高病理分期、临床转移相关,因此导致肾透明细胞癌患者预后较差。免疫组化检测到的GPD1L蛋白表达与TCGA数据库中mRNA低表达均为肾透明细胞癌患者OS的影响因素。