关节软骨由软骨细胞、Ⅱ型胶原和蛋白多糖等构成,紧密结合于骨面,起缓冲压力、减少摩擦的作用。创伤、退行性疾病等因素引起的软骨损伤会导致患者关节疼痛、活动受限,严重可致运动功能障碍,从而降低生活质量。关节软骨损伤的发病率日益增高,Emans等（2010年）提出：在美国每年约有100万关节软骨损伤患者,其中超过25万者需要接受手术治疗,这给患者及社会造成巨大经济负担。关节软骨表面光滑,缺乏神经支配及血管供给,必须从关节液中汲取营养,因此关节软骨自身修复能力很差,软骨缺损直径一旦超过3 mm便很难恢复原有状态。以往的治疗手段,如微骨折术、软骨下钻孔术、骨膜移植等,尚无法恢复其原有结构与功能。组织工程化软骨目前仍是研究热点,并且已逐步试用于临床,其为关节软骨修复提供了新的生机。组织工程研究的三大要素包括支架材料、有软骨分化能力的种子细胞和细胞调节生长因子。支架材料是种子细胞和生长因子修复损伤软骨的载体,其作用至关重要。理想的支架应符合以下条件：①有良好的生物相容性,可促进种子细胞黏附,对细胞无毒性作用,不易引发炎症反应;②有良好的生物活性,能维持软骨细胞的表型表达;③有良好的生物降解性以利于细胞增殖;④能为软骨细胞生长提供物理环境及力学支持;⑤具有疏松多孔的三维结构以便于软骨细胞的黏附生长和新陈代谢[1]。
最大程度地模拟天然细胞外基质的精细结构及成分是软骨组织工程支架设计的原则之一[2]。经过多年的研究,新型组织工程支架相对以往不断优化,逐渐向多重复合性、仿生性、水凝胶、纳米材料等方向发展。本文旨在对近年来软骨组织工程中新型支架的材料、设计及特性等的研究进展进行综述。
一、新型支架材料
1. 天然材料
软骨组织工程天然衍生支架的生物相容性良好,但同时也存在降解速率较快、机械性能较差而且来源有限等不足。天然衍生支架的常用材料有胶原、壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸、硫酸软骨素等。目前许多专家倾向于研究天然材料复合支架,通过耦合不同种类的材料,将天然支架材料的缺点消弭,同时将其优点发挥到极致。近年来所研究的新型支架多采用胶原、壳聚糖等热点天然材料[3]。
1.1 胶 原
胶原是一种很有吸引力的生物医学应用材料,是哺乳动物组织中最丰富的蛋白质,且易生物降解,抗原性低。胶原作为用于修复组织的生物材料,其主要缺点是降解速度相对较快,机械性能很快丧失。为了改善这项不足,Thomas等（2007年）设计研究出一种新型支架材料——由Ⅰ型胶原和羟基磷灰石（HAP）纳米颗粒组成的静电纺纳米纤维生物复合材料支架,结果表明无机纳米粒子的加入显著提高支架拉伸强度和弹性模量,戊二醛进行胶原的气相化学交联进一步提高了机械性能。
1.2 壳聚糖
壳聚糖是一种以甲壳素为原料的可生物降解的阳离子氨基多糖,因其结构类似于天然糖胺而被广泛应用于各种组织工程中。壳聚糖的表面具有亲水性,可促进细胞黏附、增殖、分化。此外,壳聚糖还具有抗菌活性,具有良好的生物相容性。Suh等（2000年）提出：基于壳聚糖的植入物引起的异物反应小,几乎无纤维包绕。目前壳聚糖在可注射水凝胶支架材料中常见,Jia等[4]将兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSC）封装于可注射壳聚糖水凝胶中,探讨其修复兔股骨髁间滑车软骨的能力。研究证实壳聚糖水凝胶对rbSF-MSC具有良好的生物相容性,体内修复评估表明实验组修复软骨效果明显优于对照组或空白组。这为修复关节软骨缺损提供了新途径,具有重大应用价值。Yan等（2010年）发现,壳聚糖-β-甘油磷酸酯-羟乙基纤维素（CH-GP-HEC）水凝胶支架的生物相容性、生物降解性和细胞相容性均良好,可在生理温度（37℃）下从溶胶转变为水凝胶,促干细胞成软骨分化能力也显著增强。Fang等[5]研究了一种新型的多孔聚L-谷氨酸/壳聚糖聚电解质复合物（PEC）微球,与软骨细胞共培养进行软骨再生。研究显示该微球与单纯壳聚糖微球比较,更利于软骨细胞附着和增殖。体内实验表明该微载体与软骨细胞可成功形成软骨组织,是软骨组织工程的有效载体。
2. 人工合成材料
人工合成材料的降解速度可控,易于塑形,来源不受限制,物理机械性能好。但其亲水性及生物相容性不如天然支架材料,细胞黏附性较弱,可出现免疫反应、排斥反应等。目前新型支架材料研究常将人工合成材料与天然材料等共混制备成复合材料,以改善材料的生物相容性。常用聚乳酸（PLA）、聚已内酯（PCL）、PLA-乙醇酸共聚物（PLGA）等作为人工合成支架材料。
2.1 PCL
PCL在生物医学研究领域应用较广泛,已经被FDA批准应用于临床[6]。Malheiro等（2010年）首次报道了PCL/壳聚糖共混纤维的制备及其在组织工程支架中的应用。以甲酸/丙酮（70∶30）为溶剂,甲醇为混凝剂,采用湿法纺丝法制备了壳聚糖和PCL共混纤维,其具有结构空间较宽且直径可控的特性,表面存在微米级粗糙度和孔隙率,有利于细胞附着。通过评估聚合物之间的相容性,包括红外光谱成像、壳聚糖玻璃化转变、可控溶胀试样的动态力学分析等,证明PCL/壳聚糖共混纤维可应用于软骨组织工程支架。
2.2 PLGA
PLGA由乳酸和乙醇酸2种单体聚集组成。PLGA的生物相容性和生物可降解性同样被FDA认可,批准应用于临床。曹豫江[7]采用溶液浇铸法制备出PLGA-骨形态发生蛋白-磷脂复合物（PLGA-BMP-2-磷脂复合物）,结果显示磷脂可以增强PLGA和BMP-2的结合能力,复合物在细胞因子的体外缓释方面有着绝对优势,其体外实验证实PLGA-BMP-2-磷脂复合物能够促进细胞的黏附、增殖和分化。PLGA-BMP-2-磷脂复合物植入动物模型体内后,经过长时间观察（8、12周）,实验组与对照组之间细胞的黏附、增殖和分化有显著差异。研究表明PLGA-BMP-2-磷脂复合物能为软骨组织工程提供一种新型的生物材料。Kim等[8]专门为兔子的全厚度软骨缺损设计了载有BMP-7纤维状PLGA支架,支架为滑膜间充质干细胞（synMSC）的生长和宿主整合提供了有效的微环境,synMSC与BMP-7实现协同治疗效果。电喷雾到支架上的BMP-7负载PLGA纳米粒子在2周内持续释放BMP-7,以符合其在刺激早期软骨内骨化的作用。支架载有的synMSC与BMP-7的联合给药可导致高蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的诱导,并形成透明软骨。Wang等（2010年）设计了由骨髓间充质干细胞（BMSC）、编码转化生长因子-β1（PDNA-TGF-β1）的质粒DNA、纤维蛋白凝胶和PLGA海绵组成的复合结构。为提高基因转染效率,以阳离子化壳聚糖衍生物N,N-三甲基壳聚糖氯化物（TMC）为载体。TGF-β1在体内4周时表达与2周时比较有显著性差异（P < 0.01）。植入12周后,实验组成功修复软骨缺损,新软骨与周围组织及软骨下组织结合良好。免疫组织化学检查（免疫组化）和糖胺聚糖染色证实再生软骨中Ⅱ型胶原的数量和分布与透明软骨相似。因此,将PLGA海绵/纤维蛋白凝胶支架与骨髓间充质干细胞和基因治疗相结合是修复软骨缺损的有效方法,具有广阔的应用前景。
二、新型支架设计及特性
1. 可注射水凝胶支架
水凝胶是一种通过物理相互作用或共价键交联的具有三维网状结构的亲水性聚合物,能够吸收大量水分而溶胀,并在溶胀之后能够继续保持其原有结构而不被溶解。可注射水凝胶由于其物理性质类似于天然的细胞外基质和可通过微创注射的特点而受到了广泛关注[9]。过去10年间涌现出了大量具有光敏、温敏、因子缓释功能的新型水凝胶材料。
1.1 水凝胶的易塑形性
温敏水凝胶在软骨组织工程中有许多优点：①种子细胞容易嵌入凝胶中;②温敏水凝胶能填补不规则软骨缺损,防止前体溶液的不良扩散;③在温和的生理条件下引发凝胶化,与其他注射水凝胶相比更便捷[10]。Mellati等[11]研制了一种热敏水凝胶壳聚糖-g-聚N-异丙基丙烯酰胺（CS-g-PNIPAAm）作为间充质干细胞（MSC）载体,并为其增殖和分化提供支持。生化分析显示,培养28 d后,包封在合成的水凝胶中的MSC的糖胺聚糖的分泌增加了6倍,总胶原分泌增加了7倍。其组织学和免疫组化鉴定证实了软骨细胞的分化。研究结果表明,载有细胞的三维热敏水凝胶是创造仿生结构的一个很有前景的途径。Liu等[12]研发了一种新型可注射的热敏羧甲基几丁质（CMCH）水凝胶,所得的CMCH溶液为透明液体,在低温下易流动,并在37℃下迅速凝胶化。通过改变温度和羧甲基化程度,可以轻易地调节CMCH水凝胶的胶凝时间,有利于室温下的细胞封装,在人体温度下原位形成水凝胶。此外,磷酸盐缓冲液中的CMCH水凝胶保持稳定和连续的多孔结构,在溶菌酶或透明质酸酶存在下可降解。CMCH水凝胶的小鼠体内研究显示良好的原位凝胶形成和组织生物相容性。因此,可生物降解的热敏可注射水凝胶在生物医学中具有巨大的应用潜力。
1.2 水凝胶的弹性及孔隙率
理想的可注射性支架应具有良好的流动性及生物相容性,适合种子细胞生长,并且具有一定力学强度、具备合适的孔隙率。然而,力学特性及孔隙率是水凝胶支架的短板。尹合勇等[13]通过将负载软骨细胞的Cytodext-3微载体与藻酸钠水凝胶复合制备得到可注射性Cytodext-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架,复合微载体的水凝胶支架的杨氏弹性模量高于藻酸钠水凝胶支架。证明微载体的加入可以改善水凝胶复合体的力学性能,软骨细胞在复合体中能保持更高的活性。Abbadessa等[14]则运用近年来热门的3D打印技术设计一种基于甲基丙烯酸硫酸软骨素和热敏性高聚化合物的水凝胶支架,实验证实该支架包埋的软骨细胞在6 d的培养期内保持活力并增殖,3D打印技术的融入使水凝胶支架具有可调控的孔隙率及更好的塑形性。
2. 纳米复合支架
随着纳米技术迅速发展,应用于生物医学领域的纳米材料多种多样。纳米颗粒具有较大的比表面积,能增强界面作用、提高材料的力学性能、增加蛋白吸附能力和生物活性,同时其具有较高的化学活性,可高效传递生长因子[15]。Engler等（2006年）提出：天然干细胞微环境中细胞外基质具有特定的力学性质和拓扑结构,当支架材料的硬度和弹性模量接近某种天然机体组织时,可以诱导干细胞向该方向分化。纳米复合材料的出现有效解决了水凝胶等仿生支架机械强度弱的问题。纳米复合支架可以模拟软骨结构和生物特性,在保证生物活性的同时,提高细胞的黏附能力。多孔的纳米纤维支架材料为软骨内膜细胞之间以及细胞与基质之间的相互作用提供了适宜的微环境[16]。
2.1 纳米纤维高孔隙率
三维纳米纤维支架材料的制备过程多采用静电纺丝技术。Xu等[17]以创新、便捷的方式成功制备了电纺丝PCL三维纳米支架。通过热诱导纳米粒子自团聚,然后冷冻干燥,形成具有相互连接、层次分明的孔隙结构,孔隙大小可达300 μm左右。新型PCL三维支架柔软且有弹性,孔隙率可达96.4%,其形态结构类似于自然细胞外基质,非常适合细胞生长和组织形成。其体外研究表明,该支架具有较高的细胞活力,能够促进BMP-2诱导软骨形成。体内结果相似,证明纳米纤维支架可作为促进骨与软骨再生的支撑环境。
2.2 纳米微球缓释细胞因子
纳米支架对于细胞因子缓释作用亦有帮助。訾云鹏等（2017年）提出以Kartogenin作为促成软骨分化的细胞因子,制备负载Kartogenin的纳米HAP/壳聚糖支架,实验证实该纳米微球支架可以在1个月内稳定释放Kartogenin,起到缓释作用。与此相似,Sun等[18]研究人脂肪源性干细胞（HADSC）和TGF-β3微球联合应用对关节软骨再生的促进作用,其包封率试验表明,（73.8±2.9）%的TGF-β3被包裹在微球中,其持续释放了至少30 d,并且通过动物实验证明纳米微球对于软骨组织再生起促进作用。
2.3 纳米支架提高机械性能
以天然聚合物为基础的水凝胶体系具有良好的生物相容性和生物降解性,但其无足够的机械强度来支撑。不同的金属和非有机纳米粒子已被用来提高水凝胶纳米复合材料的力学性能[19]。这些纳米颗粒包括石墨烯氧化物、石墨烯、nHA、磷酸钙、碳纳米管和生物活性玻璃[20]。对于新型纳米材料“量子点”,有研究显示胶原与量子点交联后成胶速度变快,生物相容性好,溶胀率降低,显著提高了材料力学性能和抗降解能力,具有促进干细胞的成软骨分化能力,并且可抑制纤维软骨的形成,最终新生软骨呈现透明软骨形态。Liu等（2011年）报道了由星形可降解聚合物（星型聚乳酸）自组装而成的纳米纤维中空微球作为一种可注射的细胞载体,高度多孔的纳米纤维中空微球将模拟细胞外基质的结构与注射形式结合在一起,可以提高支架的机械强度,同时有效地容纳细胞并增强细胞增殖再生能力。研究表明可注射纳米纤维中空微球是一种优良的软骨细胞微载体,能为促进高质量的透明软骨再生提供新思路。
三、展 望
关节软骨损伤使全世界数百万患者遭受严重病痛折磨,对社会产生了深远影响。经过多年来的不断努力,软骨组织工程研究取得了许多令人瞩目的进展,新型支架比以往更具优势。越来越多的研究表明,支架的力学性质、三维结构、多孔性质对细胞表型行为有着显著影响。此外,仿生传递基质的设计必须使其在结构上类似于纳米级的天然组织,复合支架的设计有助于改善界面性能。由纳米复合材料制成的支架可以满足软骨修复过程多种不同的要求。纳米技术是软骨组织工程的一项创新进展,有可能开创生物医学工程的一个新时代。然而,诸多问题仍丞待解决,包括：如何使材料及制备过程更加高效、经济以便于结合临床;如何真正实现组织工程软骨与周围组织的有机整合;如何使组织工程软骨植入后不仅能提供即时的力学支撑,而且还能确保长期承重等。虽然目前临床中无明确可靠的方法来治愈软骨缺损,但新型支架等研究成果不断涌现为软骨组织工程的进展奠定了基础,为软骨损伤患者带来了曙光。