慢性非细菌性前列腺炎（CAP）是50岁以下成年男性常见的泌尿系统疾病,是50岁以上男性的第3位泌尿系统常见病[1]。CAP的病因和发病机制非常复杂,任何单一机制均不能对其众多复杂的临床表现作出满意的解释[2]。目前,临床上对于CAP仍以药物治疗为主,虽然能在一定程度上改善患者症状,但是长期用药容易增加并发症发生率,影响患者治疗耐受性及预后。冲击波治疗作为一种新型治疗手段,具有周期短、频谱广等特点,已经广泛用于泌尿系结石、痉挛性疾病的治疗,而近年其在慢性骨盆疼痛综合征（CPPS）中的治疗作用也备受关注[3]。冲击波治疗在CAP患者中的作用研究较少[4]。本研究采用随机对照方式,探讨不同能量体外冲击波对CAP大鼠的前列腺组织及相关细胞因子表达的作用与影响,现报告如下。
材料与方法
一、实验动物
健康雄性SD大鼠（8周龄,200 g）34只,购于广州中医药大学实验动物中心,合格证号：SCXK（粤）2013-0034,实验期间自由饮食（消毒自来水,普通大鼠饲料）,自然采光。
二、主要试剂及仪器
主要试剂包括：完全弗氏佐剂（FAC）,含0.5% Triton X-100（内皮细胞裂解液）的生理盐水（自配）,Trizol RNA 抽提剂（美国Invitrogen 公司）,大鼠IL-1β ELISA试剂盒、大鼠TNF-α ELISA试剂盒、大鼠神经生长因子（NGF）ELISA试剂盒（武汉纯度生物科技有限公司）,即用型兔UItraSensitive SP超敏试剂盒（迈新生物技术有限公司）,IL-6（武汉赛维尔生物科技有限公司）。主要仪器包括：电动匀浆器（上海净信）,实时定量PCR扩增仪（Roche 公司）,冲击波治疗仪（BTL-5000SWT）,酶标仪（ThermoFisher）,漩涡混合器（其林贝尔仪器制造有限公司）,纯水机（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）,冰箱（青岛海尔股份有限公司）,脱水机、石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）,切片机（上海莱卡仪器有限公司）。
三、方 法
1. SD大鼠前列腺蛋白乳化混悬液的制备
取10只健康雄性SD大鼠,断脊处死,局部皮肤消毒,下腹正中切口,用剪刀剪开大鼠腹部皮肤和肌肉,提起膀胱,暴露前列腺及精囊腺,剥离前列腺,剪除多余的脂肪组织,将精囊腺与前列腺分离,剪下的前列腺组织于生理盐水中洗净3 ~ 5遍待用。用眼科剪剪碎前列腺组织,分批加入预先高温灭菌的0.5% Triton X-100生理盐水溶液40 ml,用电动匀浆器制成匀浆。烧杯放置在冰块中,保持低温。把匀浆充分的前列腺组织用吸管吸入离心管中,天平配平后置入高速离心机中以4 ℃、12 000转/分离心30 min,用吸管吸去上层脂肪组织,取上清液,放入冷冻管-20℃保存备用。取余下的上清液0.2 ml,等比稀释后依次放入孔板,在酶标仪上读取光密度（OD）值。然后采用紫外法测定蛋白含量,蛋白含量（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260） ×稀释倍数,测定上清液的蛋白含量（所计算标本为稀释250倍的溶液）。用生理盐水将紫外法测定蛋白浓度的原液稀释至40 mg/ml。用FAC按1∶1的比例加入稀释好的前列腺蛋白液中,将试管放置于冰块内保持低温,用乳化匀浆机进行乳化,当滴1滴至水面上长时间保持圆珠状而不散开时即可。
2. 动物分组及CAP模型制备
余24只SD大鼠随机分为对照组、模型组、低能量密度组（低剂量组）、中能量密度组（中剂量组）,每组6只。除对照组外,其他3组大鼠采用下述方法造模：将实验大鼠采用水合氯醛麻醉,多点皮下注射大鼠前列腺蛋白乳化混悬液1.0 ml,剂量为15 mg/ml,30 d再注射1次。对照组大鼠在0、30 d皮下多点注射磷酸盐缓冲液1.0 ml。45 d后,出现特异性的形态学与分子生物学改变即模型制作成功。本实验中动物的饲养与处死均符合动物伦理学要求。
3. 冲击波治疗
造模成功后,对大鼠进行水合醛麻醉,将冲击波的第二焦斑定于大鼠的前列腺组织上,进行冲击波治疗。低剂量组予1.5 bar 10 Hz 1000次电击、中剂量组予3.5 bar 10 Hz 1000次电击,每周1 次,连续治疗4周。
4. 大鼠前列腺指数检测
冲击波治疗4周后,称量大鼠体质量,尾静脉取血,然后处死,迅速取出前列腺组织,并称量大鼠前列腺湿重,计算对照组、模型组、低剂量组、中剂量组的大鼠前列腺指数,前列腺指数=前列腺湿重（mg）/大鼠体质量（g）。
5. 大鼠白细胞数量和卵磷脂小体密度变化
取各组大鼠前列腺组织,收集前列腺按摩液1滴于显微镜下观察白细胞数目及卵磷脂小体密度的变化,观察并记录卵磷脂小体密度,评分标准为：满视野4分,3/4 视野3分,1/2视野2分,1/4视野1分。
6. 大鼠前列腺组织的病理学检查
采用苏木素-伊红（HE）染色：将大鼠前列腺组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、3 μm厚切片。水浴、烤片,37 ℃过夜静置。依次进行脱蜡、水化、HE染色和中性树胶封片,显微镜下观察腺体、导管区和间质的变化,并采集图片。每张切片分别在200倍及400 倍光镜下拍10个视野。
7. 血清、组织匀浆上清液中NGF、IL-1β、TNF-α水平的检测
治疗 4 周后,大鼠尾静脉取血,而后取前列腺组织,眼科剪剪碎,倒入匀浆器中,移液管加入生理盐水1 ml,进行匀浆（匀浆器下端浸入干冰中）。随后将组织匀浆在低温下以3000转/分离心10 min。采用双抗体夹心ELISA法检测各组大鼠血清、组织匀浆上清液中NGF、IL-1β、TNF-α水平,操作严格按照试剂盒说明书进行。
8. 前列腺组织中IL-6蛋白表达强度检测
采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）染色：将大鼠前列腺组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、3 μm厚切片,水浴、抗原修复,切片上划蜡滴加非免疫性动物血清,室温封闭 30 min。最后切片经一抗（IL-6）处理,4 ℃过夜,磷酸盐吐温缓冲液洗涤5次,每次3 min,以生物素标记的第二抗体室温下孵育40 min。SP溶液室温孵育15 min,二氨基联苯胺（DAB）-过氧化氢显色。每张切片分别在100及400 倍光镜下拍10个视野。IL-6阳性表达为细胞和（或）胞浆中见棕黄色的颗粒,分别对镜下阳性细胞比例和染色强度进行评分,阳性细胞比例0% ~ 5%为0分、5% ~ 25%为1分、26% ~ 50%为2分、51% ~ 75%为3分、75% ~ 100%为4分,染色强度无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。阳性细胞比例和染色强度计分乘积为阳性等级,0分为阴性、1 ~ 4分为弱阳性、5 ~ 8分为阳性、9 ~ 12分为强阳性。
四、统计学处理
使用SPSS 22.0 分析数据。计量资料以$\bar{x}±s$表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、4组大鼠体质量、前列腺湿重及前列腺指数的比较
4组大鼠的体质量相近（P > 0.05）。与对照组比较,模型组、低剂量组和中剂量组前列腺湿重及前列腺指数均较高（P均< 0.05）。与模型组及低剂量组比较,中剂量组前列腺指数较低（P均< 0.05）,见表1。
表1 4组大鼠体质量、前列腺湿重和前列腺指数比较（$\bar{x}±s$） |
| 组 别 | n | 体质量 （g） | 前列腺湿重 （mg） | 前列腺指数（mg/g） |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 382±19 | 1133±65 | 2.97±0.08 |
| 模型组 | 6 | 394±16 | 1369±48a | 3.48±0.09a |
| 低剂量组 | 6 | 395±27 | 1327±53a | 3.36±0.10a |
| 中剂量组 | 6 | 409±29 | 1274±89a | 3.12±0.11abc |
| F值 | 1.324 | 14.706 | 33.403 | |
| P值 | 0.295 | < 0.001 | < 0.001 |
注：与对照组比较,aP < 0.05;与模型组比较,bP < 0.05;与低剂量组比较,cP < 0.05 |
二、4组大鼠前列腺液中白细胞数量和卵磷脂小体密度的变化
与对照组相比,模型组、低剂量组和中剂量组前列腺液中白细胞增多（P均< 0.05）。与模型组对比,中剂量组前列腺液中白细胞减少（P < 0.05）。与低剂量组相比,中剂量组前列腺液中白细胞减少（P < 0.05）。与对照组相比,模型组的卵磷脂小体密度下降（P < 0.05）,低剂量组、中剂量组的卵磷脂小体密度有所升高（P均< 0.05）,中剂量组的卵磷脂小体密度高于低剂量组（P < 0.05）,见表2。
表2 4组大鼠前列腺液白细胞及卵磷脂小体密度比较（$\bar{x}±s$） |
| 组 别 | n | 白细胞（×106/L） | 卵磷脂小体密度（分） |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 6.1±0.1 | 0.23±0.03 |
| 模型组 | 6 | 15.5±0.9a | 0.10±0.04a |
| 低剂量组 | 6 | 14.7±0.6a | 0.58±0.10ab |
| 中剂量组 | 6 | 12.0±0.7abc | 0.93±0.12abc |
| F值 | 255.945 | 129.704 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 |
注：与对照组比较,aP < 0.05;与模型组比较,bP < 0.05;与低剂量组比较,cP < 0.05 |
三、治疗后4组大鼠前列腺组织病理形态分析
四、4组大鼠血清和前列腺组织中NGF、IL-1β和TNF-α水平比较
1. 4组大鼠血清NGF、IL-1β和TNF-α水平比较
与对照组相比,模型组大鼠血清中NGF、IL-1β和TNF-α水平均升高（P均< 0.05）,低剂量组大鼠血清中NGF、TNF-α水平均升高（P均< 0.05）,中剂量组大鼠血清中NGF、IL-1β和TNF-α水平与对照组比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。与模型组比较,低剂量组、中剂量组大鼠血清中NGF、IL-1β和TNF-α水平均降低（P均< 0.05）。与低剂量组相比,中剂量组大鼠血清中NGF、TNF-α水平均降低（P均< 0.05）,见表3。
表3 4组大鼠血清NGF、IL-1β和TNF-α水平比较（$\bar{x}±s$） ng/L |
| 组 别 | n | NGF | IL-1β | TNF-α |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 226±39 | 22.3±5.9 | 189±19 |
| 模型组 | 6 | 382±33a | 38.1±1.8a | 323±17a |
| 低剂量组 | 6 | 297±30ab | 27.4±1.7b | 248±26ab |
| 中剂量组 | 6 | 258±31b | 26.3±5.4b | 217±24bc |
| F值 | 24.129 | 15.687 | 41.743 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
注：与对照组比较,aP < 0.05;与模型组比较,bP < 0.05;与低剂量组比较,cP < 0.05 |
2. 4组大鼠前列腺组织中NGF、IL-1β和TNF-α水平比较
与对照组相比,模型组大鼠前列腺组织中NGF、IL-1β和TNF-α水平均升高（P均< 0.05）,低剂量组大鼠前列腺组织中NGF、IL-1β水平均升高（P均< 0.05）,中剂量组大鼠前列腺组织中仅NGF水平升高（P < 0.05）。与模型组相比,低剂量组与中剂量组大鼠前列腺组织中NGF、IL-1β和TNF-α水平均下降（P均< 0.05）。中剂量组大鼠前列腺组织中NGF水平低于低剂量组（P < 0.05）,见表4。
表4 4组大鼠前列腺组织中NGF、IL-1β和TNF-α水平比较（$\bar{x}±s$） ng/L |
| 组 别 | n | NGF | IL-1β | TNF-α |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 355±39 | 27.6±6.0 | 308±19 |
| 模型组 | 6 | 494±33a | 43.3±1.8a | 447±17a |
| 低剂量组 | 6 | 422±30ab | 34.9±1.7ab | 359±26b |
| 中剂量组 | 6 | 387±31abc | 31.5±5.4b | 332±24b |
| F值 | 18.706 | 15.901 | 45.993 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
注：与对照组比较,aP < 0.05;与模型组比较,bP < 0.05;与低剂量组比较,cP < 0.05 |
五、4组大鼠前列腺组织中IL-6的表达情况
讨 论
随着临床与实验研究逐步深入,人们的焦点更多集中在免疫因素对CAP的作用上[7]。细胞因子的变化是免疫因素参与前列腺炎症调节机制中最重要的检测指标,其主要涉及调节性细胞因子、抗炎症细胞因子和促炎症细胞因子[8,9]。IL-1β、TNF-α属于促炎症细胞因子,是炎症反应中最早出现的细胞因子,通过增加趋化因子（IL-8、ENA-78）、环氧酶-2、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和细胞黏附因子的表达来促进全身炎症反应发展。邹如政等[10]报道,CAP模型小鼠的IL-1β、TNF-α水平高于正常对照组。NGF作为一种蛋白,可调节周围和中枢神经元的生长发育,维持神经元的存活。有研究表明,在自身免疫性前列腺炎小鼠模型中,NGF的表达与疼痛的严重程度呈正相关[11]。
IL-6主要由单核巨噬细胞、内皮细胞产生,能诱导激活T、B淋巴细胞的分化,促进中性粒细胞的溶酶体活性和吞噬功能。Šutulović等[12]报道,CAP/CPPS患者前列腺按摩液中的IL-6水平高于对照组,且增加癫痫发作的易感性,也与疼痛的缓解相关。白细胞数及卵磷脂小体密度是前列腺炎的共同检测指标。其中前列腺液中的白细胞数目反映了腺体上皮受损的程度,而卵磷脂小体作为前列腺液的成分之一,能起到保护精子的作用。临床上,白细胞增多常与卵磷脂小体减少相对应。
本研究采用SD大鼠前列腺蛋白提纯液辅以免疫佐剂注射诱导自身免疫性前列腺炎,即CAP模型,模型制备方法已被广泛认可[13]。本研究显示,模型组大鼠的前列腺湿重及前列腺指数均高于对照组,同时白细胞多于对照组、卵磷脂小体密度低于对照组。进一步通过HE染色观察各组小鼠腺体、导管区和间质的病理变化,结果显示对照组前列腺腺体分布疏散,管腔可见分泌物,而模型组腺上皮细胞变性,前列腺增生,炎细胞聚集。血清和前列腺组织中IL-1β、TNF-α和NGF的表达中,模型组小鼠各细胞因子的水平均高于对照组,免疫组化也显示模型组IL-6蛋白表达为阳性,而对照组IL-6蛋白表达水平为阴性。以上这一系列检测均从不同角度说明诱导后的模型组出现不同程度的组织炎症指征,即自身免疫因素参与了CAP的发病过程,在这个过程中,前列腺体质量及指数受影响,细胞因子间的动态平衡受到破坏,HE检测腺体局部也出现炎症病变,充分表明CAP模型建模成功。
本研究的主要目的是研究不同能量的体外冲击波对CAP的作用。体外冲击波法作为一种较保守的治疗方法,其主要通过能量转换和传递,造成不同密度的组织之间产生机械应力效应、空化效应及神经阻滞效应;通过机械力效应加速病灶血管循环,促进组织再生;而通过神经镇痛效应可引起细胞周围自由基的改变,释放抑制疼痛的物质一氧化氮,从而缓解疼痛症状。近年体外冲击波逐渐转向慢性疼痛治疗领域,Mattheolabakis等[14]通过采用冲击波治疗,下调降钙素基因作用的坐骨神经元受体,从而抑制痛觉的产生,使大鼠步行距离明显改善。同时通过冲击波作用,也能调节炎症细胞的变化。Sukubo等[15]用低能量的冲击波干预巨噬细胞可抑制促炎症细胞因子的产生,同时促进抗炎物质的生成。近年来,低能量体外冲击波在ⅢB型CAP患者中得到应用,且效果理想。本研究探讨了2种不同能量（分别为低剂量、高剂量）冲击波对CAP大鼠的疗效。结果显示,低剂量组、中剂量组CAP大鼠体质量及前列腺湿重下降、白细胞减少、卵磷脂小体密度升高,中剂量组的前列腺指数有所下降,HE显示模型组腺上皮细胞变性、前列腺增生、炎症细胞聚集,低剂量组间质稀疏、炎细胞聚集,与模型组差异不大,中剂量组管腔内虽可见炎症细胞聚集,但相比模型组,未见前列腺增生,这在一定程度上说明炎症细胞聚集相对较少。另外,低剂量组、中剂量组血清和前列腺组织中IL-1β、TNF-α及NGF水平均低于模型组,中剂量组降低更明显。进一步免疫组化检测显示低剂量组和中剂量组IL-6蛋白减弱,但不明显,这一系列结果表明通过冲击波可减轻炎症反应,可能是其抑制炎症细胞的迁移、黏附,阻止其穿越血管内皮细胞,减轻炎症细胞对前列腺组织的浸润,最终减少炎症介质在前列腺组织的释放,减轻前列腺组织的炎症免疫损伤。本研究中,低剂量组和中剂量组与对照组相比,各指征仍部分存在差异,说明所用体外冲击波的强度在后续试验研究中还可进一步进行优化调整,以期达到更好的治疗效果。
综上所述,低能量密度及中能量密度冲击波可减轻CAP大鼠前列腺组织的炎症反应,且中能量密度冲击波效果更好,这为将来CAP的靶点治疗提供了一定的实验依据。有关冲击波对CAP的具体作用机制有待日后研究论证。