对象与方法
一、研究对象
二、研究方法
1.临床资料分析
回顾性对所有患儿的临床资料进行分析,包括年龄、性别、临床表现、实验室检查、结肠镜及黏膜病理检查。
2.结肠黏膜标本的收集及处理
行纤维结肠镜时用活检钳取出患儿结肠黏膜后迅速固定于10%甲醛溶液中,送我院病理科进行常规石蜡包块,连续作厚5 μm的切片3张,60℃烤箱过夜,室温下保存备用。
3.采用免疫组织化学（组化）法检测患儿结肠黏膜中TLR4、IL-5表达
切片脱蜡至水,柠檬酸抗原修复,3%过氧化氢去离子水消化,滴加一抗（TLR4、IL-5,Bioworld, USA,工作浓度1∶00）,4℃过夜,PBS浸洗后,滴加二抗,DAB显色,经苏木素复染,盐酸酒精溶液分化,封片。用PBS代替一抗作阴性对照。
4.结果判读
参照文献[5],由2名病理医生单独判断免疫组化结果。显微镜下观察细胞质或细胞膜呈黄色、棕黄色或棕褐色为阳性。染色强度评分：按细胞显示深浅记分,分为4级,0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。阳性细胞面积评分：按阳性细胞所占面积分为4级,0分为阴性,1分为阳性细胞≤1/3,2分为1/3 ~ 2/3,3分为 > 2/3。阳性表达水平采用染色强度评分×阳性细胞面积评分的积分表示,积分为0判断为0分,积分为1 ~ 2判断为1分,积分为3 ~ 4判断为2分,积分为6 ~ 9判断为3分。
三、统计学处理
采用SPSS 13.0进行分析,定性资料用例（%）表示,其中无序分类资料组间比较用Fisher确切概率法,等级资料组间比较用秩和检验。2个连续型变量相关性采用Pearson相关分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。
结 果
一、EC组和对照组的临床表现比较
EC组28例,男20例、女8例,年龄（5.1±2.8）岁,便血14例（50%）,主要为黏液血丝便,不同程度的腹痛12例（42.8%）,腹泻8例（28.6%）,恶心、呕吐3例（10.7%）,腹胀1例（3.5%）,营养不良1例（3.5%）。对照组25例,男18例、女7例,年龄（5.3±2.7）岁,均表现为腹痛,主要为脐周痛或中上腹痛。与对照组相比,EC组患儿便血、腹泻的比例升高,差异有统计学意义（P均< 0.05）,以腹痛为主要症状的EC患者比例较低,差异亦有统计学意义（P < 0.05）,见表1。
表1 EC组和对照组患儿临床表现比较[例（%）] |
| 临床表现 | EC组（28例） | 对照组（25例） | P值 |
|---|---|---|---|
| 便血 | 14（50.0） | 0（0） | < 0.001 |
| 腹痛 | 12（42.8） | 25（100.0） | < 0.001 |
| 腹泻 | 8（28.6） | 0（0） | 0.005 |
| 恶心/呕吐 | 3（10.7） | 0（0） | 0.238 |
| 腹胀 | 1（3.5） | 0（0） | 1.000 |
| 营养不良 | 1（3.5） | 0（0） | 1.000 |
二、EC组和对照组实验室检查结果比较
EC组EOS增高者5例,4例患儿血红蛋白降低,8例患儿大便潜血试验阳性,所有患儿大便寄生虫检测均阴性,1例患儿血白蛋白降低,7例血清总IgE增高,8例患儿食物过敏原 IgE 检测阳性,提示主要对牛奶、鸡蛋、 大豆、鳕鱼、螃蟹过敏。对照组血常规、粪便常规、总IgE、食物过敏原IgE、肝肾功能均正常。与对照组相比,EC患儿血清总IgE增高、食物过敏源IgE检测阳性、大便潜血试验阳性比例均较高（P < 0.05）,见表2。
表2 EC组和对照组实验室检查结果比较[例（%）] |
| 项 目 | EC组 （28例） | 对照组 （25例） | P值 |
|---|---|---|---|
| EOS增高 | 5（17.6） | 0（0） | 0.053 |
| 血红蛋白降低 | 4（14.2） | 0（0） | 0.113 |
| 血清总IgE增高 | 7（25.0） | 0（0） | 0.011 |
| 食物过敏原IgE检 测阳性 | 8（28.6） | 0（0） | 0.005 |
| 血白蛋白降低 | 1（3.5） | 0（0） | 1.000 |
| 大便潜血试验阳性 | 8（28.6） | 0（0） | 0.005 |
| 大便寄生虫检测阴性 | 28（100.0） | 25（100.0） | / |
三、EC组和对照组内镜和病理检查结果比较
四、EC组和对照组TLR4水平比较
五、EC组和对照组IL-5水平比较
六、结肠黏膜TLR4、IL-5表达的相关性
所有患儿实验结果显示TLR4、IL-5表达水平呈负相关（r = -0.532,P < 0.05）。
讨 论
EGID是一种少见的可影响胃肠道从食道到直肠的任何节段或节段组合,从而产生各种临床表现的慢性炎症性肠病,最初由Kaijser于1937年描述,其特征是富含EOS的炎症,没有其它已知EOS增多的原因（即寄生虫、感染、药物反应或恶性肿瘤）。EC是一种罕见的原发性EGID,美国最近对一个基于人口的数据库进行了调查,其中包括超过3500万儿童和成人,报告的EC总体患病率为每10万名受试者中有2.1人,每10万名成人患病率为2.3,儿童每10万人中有1.6人[6]。国内报道 EC 患儿发病率明显高于国外,本组资料中我们共收集到 EC 确诊患儿 28 例,年龄1 ~ 12 岁,男女比例约1.8∶1。
虽然在过去的10年中报道的EC病例有所增加,但其病因、发生机制尚不清楚,临床可因病变累及的部位、病理、范围和程度而有所差异,主要表现为腹痛、恶心、呕吐、腹泻、体质量减轻、胃肠道出血、肠道吸收不良或腹水[7]。本组资料中患儿的临床症状主要为便血、腹泻,大多数患儿内镜检查可见结肠黏膜充血、水肿、血管纹理欠清晰、小结节样增生,严重者可见点片状的糜烂、阿弗它样溃疡。有8例患儿内镜下结肠黏膜正常。有研究表明,临床症状和实验室检查结果通常是非特异性的,可能伴有也可能不伴有外周血嗜酸性粒细胞增多症[8]。诊断需要根据胃肠道症状,通过活组织检查证实肠道EOS增多,并排除其他已知的组织EOS增多的原因。本组资料显示仅有18%的患者外周血EOS增高,推测可能是本组患儿大部分曾服用抗过敏药物的原因,并且外周血EOS的数量会随病情变化而出现波动,因此仅凭此项结果正常排除EC是不可靠的,提示外周EOS对确诊EC不是关键,而内镜下肠道组织活检证实EOS浸润> 20个/HPF是诊断EC的关键[9]。
EC的病因及发病机制尚不清楚,可能为环境、基因和免疫系统相互作用的结果,也可能与食物过敏,感染或炎症性肠病共存,大量研究报道该病与过敏因素有关[10]。而在本组中 8例患儿食物变应原IgE检查阳性,这提示过敏因素可能在发病机制中有一定的作用。通过动物实验及临床研究发现,过敏原或毒素等外源性或内源性抗原刺激EC患者产生特异性免疫球蛋白,激活T淋巴细胞,导致Th1/Th2 平衡失调,Th2 细胞分泌的细胞因子IL-5 是重要的炎症介质,Th2 细胞的优势应答导致IL-5、Eotaxin 等炎症因子产生是消化道 EOS 异常浸润和炎症发生的基础[2,8]。目前大多研究发现 IL-5 在EC的发病机制中起到非常关键的作用,它促进EOS产生、分化、活化及生存,并增强对趋化因子（如Eotaxin）的反应性,向消化道转移。Prussin研究发现 IL-5+Th2 免疫反应与EGID发生相关,而Kinoshita等[11]研究中发现嗜酸性食管炎及胃肠炎患儿的细胞因子 IL-5 同样升高。
IL-5是Th2衍生的一类细胞因子,是EOS活化的关键介质,也是EOS扩增及其从骨髓中释放所必需的[12]。当激活时,胃肠组织浸润的EOS可释放嗜酸颗粒中的细胞毒性蛋白（包括EOS阳离子蛋白、EOS过氧化物酶、EOS来源的神经毒素和主要基质蛋白） ,还可合成血小板活化因子、白三烯C4等血管活性物质,进而造成器官损伤或功能障碍和更多EOS聚集,从而形成恶性循环。Straumann等（2001年）在特发性嗜酸性粒细胞性食管炎（EE）患者食管上皮活检标本中观察到IL-5和TNF-α的表达增加,因此认为特发性EE发病机制与Th2型过敏性炎症反应有关。本研究显示EC组结肠上皮组织IL-5呈阳性表达,而对照组结肠组织IL-5呈阴性,可能与上述发病机制有关。
T淋巴细胞在免疫系统中占有重要地位,实验表明,炎症性肠病患者中其肠道病变组织可见局部CD4+ T细胞浸润并且功能异常[13]。CD4+ T细胞根据细胞因子的分泌分为Th1和Th2细胞.在正常情况下,体内的Th1和Th2处于动态平衡状态并相互调节,从而维持体内环境的稳定性。如果Th1和Th2失去平衡,则在组织和器官中发生炎症并引起疾病。Camoglio等（1998年）在溃疡性结肠（UC）小鼠模型中发现CD4+ T细胞产生大量IL-4和IL-5,单个IFN-γ正常或减少,说明UC的发生和发展与Th1/Th2的失衡强烈相关。TLR4是固有免疫系统识别病原微生物的主要受体,可以识别入侵病原体的不同分子模式,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁,在人体的免疫系统中起着重要的作用。同时它也在Th1/Th2的平衡中起着关键作用。近期研究发现 TLR4 的激活参与了某些过敏性炎症疾病的发病过程。Eisenbarth等（2002年）在用卵清蛋白建立的哮喘小鼠模型研究中发现,小鼠吸入低浓度脂多糖（LPS）TLR4的激动剂的卵清蛋白,支气管组织中 TLR4 低表达,从而产生抗原特异性 Th2 免疫应答而发生哮喘症状,而吸入较高浓度 LPS的卵清蛋白则诱导Th1免疫保护应答未出现哮喘症状。因此,TLR4介导的信号转导通路在探索哮喘等Th2免疫应答为主的过敏性疾病免疫防治机制中具有重要的研究价值。目前国内外对TLR4与EC发病的关系的研究尚未见报道,因此本研究从TLR4与Th2免疫应答关系探讨EC可能的发病机制。
本文探讨了EC患儿肠上皮细胞TLR4的表达情况。免疫组化结果显示,在EC组和对照组中,TLR4在结肠上皮细胞中均有表达,但与对照组相比,EC组结肠黏膜TLR4水平降低。本文也探讨了TLR4、IL-5相关性,结果显示它们呈负相关,即EC组患儿结肠组织中TLR4低水平表达,而IL-5呈高水平表达。对照组患儿结肠组织中TLR4高水平表达,而IL-5呈低水平表达。因此我们推测EC患儿肠组织TLR4表达明显下降,可能一定程度上使IFN-γ等Th1细胞因子的产生减少,通过调节导致Th1/Th2 平衡失调,从而倾向于Th2表型应答,释放大量IL-5细胞因子,参与EC的发生,该假设在我们前期构建的轮状病毒肠炎乳鼠动物模型中得到验证[14]。
综上所述,我们推测机体受到过敏原、毒素等刺激时,肠道上皮细胞的TLR4不能反应性增高或表达被抑制,从而导致产生抗原特异性Th2免疫应答可能是EC发病机制之一,这也为EC的预防及治疗提供新的思路。