宫颈癌是女性第二高发恶性肿瘤,也是女性恶性肿瘤死亡的第三大原因[1]。根据近年我国的统计数据,女性中宫颈癌的发病率呈逐年上升的趋势[2,3]。目前,宫颈癌的治疗方式主要有手术、放射治疗和化学治疗,但患者的生存率仍未能明显提高[4,5]。随着分子生物学及医疗技术的发展,基因治疗在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤中取得突破性的进展[6,7,8]。肿瘤的发生发展是一种涉及多因素、多步骤的繁杂过程,其中促癌基因和抑癌基因的异常表达均可参与恶性肿瘤的发病[9,10,11,12]。易洛魁家族同源盒1（IRX1）基因与神经系统发育、胚胎发育等密切相关[13,14]。研究显示,IRX1通过介导肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用[15,16]。亦有研究显示IRX1在宫颈癌中呈高表达,且与宫颈癌的临床分期密切相关[17]。然而,IRX1在宫颈癌中的功能及作用机制鲜有报道。因此,本研究探究IRX1对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响,以期为宫颈癌的基因治疗提供作用靶点。
材料与方法
一、材 料
人宫颈癌细胞株SiHa细胞株（美国标准生物品收藏中心）,DMEM培养基（美国Sigma公司）,胎牛血清、胰蛋白酶、Opi-MEM培养基（美国Gibco公司）,Trizol试剂、逆转录试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）,CCK-8试剂（日本TaKaRa公司）,IRX1短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒载体质粒及空载质粒（上海吉凯基因化学技术有限公司）,细胞蛋白提取试剂盒（美国Pierce公司）,BCA蛋白浓度检测试剂盒、电化学发光（ECL）试剂及蛋白免疫印迹法检测所需试剂（上海碧云天生物技术研究所）,鼠抗人IRX1、增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤（BCL）关联X蛋白（BAX）和BCL-2蛋白抗体及山羊抗鼠二抗（美国Cell Sigaling Technology公司）。
二、方 法
1. 细胞培养
人宫颈癌SiHa细胞株用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养液培养,置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中。待细胞贴壁生长融合度达90%后,使用0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数期的SiHa细胞进行后续研究。
2. 细胞慢病毒转染和分组
对数生长期的SiHa细胞以胰酶消化,计数后以1×105/孔接种到6孔板中,将细胞分为3组：其中未做任何处理的SiHa细胞为Control组、转染空载质粒的SiHa细胞为sh-NC组、转染IRX1 shRNA重组慢病毒载体质粒的SiHa细胞为sh-IRX1组。转染过程严格参照慢病毒转染及Lipofectamine 2000转染试剂说明书,转染后筛选并收集稳定转染的SiHa细胞。
3. IRX1基因表达水平的检测
使用实时定量PCR法。分别收集转染48 h后的各组SiHa细胞,利用Trizol试剂裂解并提取细胞中总RNA,以分光光度计对提取RNA的纯度和浓度进行鉴定。按照逆转录试剂盒说明书进行加样和扩增,将RNA逆转录成第一链模板DNA,并以GAPDH为内参基因,使用SYBR premix Ex Taq Kit试剂盒行实时定量PCR检测。反应体系包括2倍SYBR premix 10 μl、模板DNA 2 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、DEPC水6 μl。反应程序：95℃预变性30 s,95℃变性30 s、60℃退火20 s共40个循环,72℃延伸30 s。待反应结束后,分析熔链曲线确定产物的特异性,并获得Ct值,-△△CT=目的基因Ct值-内参基因Ct值,以相对定量2-△△CT法分别计算各组SiHa细胞中IRX1 mRNA相对表达量。IRX1上游引物序列5’-AGTTAAAGTCGCCCTTCCAG-3’,下游引物序列5’-CCCCGCAAAAGTAAAAGAAGAC-3’,产物长度120 bp;GAPDH上游引物序列5’-GATAC ACGGAGCACCAGGTT-3’,下游引物序列5’-CAGG TCACATACACGGTTGC-3’,产物长度158 bp。
4. IRX1、PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2蛋白表达水平的检测
使用蛋白免疫印迹法。转染48 h后各组SiHa细胞以胰酶消化,离心收集细胞,使用蛋白提取试剂盒提取各组SiHa细胞中总蛋白。加入适量上样缓冲液与蛋白混匀,加热变性,取30 μg蛋白进行加样,行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后采用半干法将蛋白转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。在5%脱脂奶粉的封闭液中封阻2 h。TBST缓冲液洗膜,分别加入相应一抗,一抗按照使用说明书进行稀释,4℃过夜杂交,TBST洗膜后加入1∶2000稀释的二抗,室温杂交1 h。TBST洗膜后以ECL显色,于暗室中使用凝胶成像系统成像拍照。以GAPDH进行标定,使用Quantity One软件分析各蛋白条带灰度值。分别计算各组SiHa细胞中目的蛋白相对表达水平。
5. IRX1对SiHa细胞增殖能力影响的检测
采用CCK-8法。对数生长期的SiHa细胞接种到96孔板中,接种密度为1×103/孔,在37℃培养箱中继续培养,待细胞生长密度达50%左右时按前述方法进行分组和转染,在转染24、48、72 h时分别向每孔细胞加入100 μl CCK-8溶液,37℃继续孵育4 h,使用多功能酶标仪测定450 nm波长处细胞吸光度（OD）值。
6. IRX1对SiHa细胞增殖影响的检测
采用克隆形成试验。各组处于对数生长期SiHa细胞以胰酶消化,离心收集细胞并制成细胞悬液,计数后分别以8×102/孔接种到6孔板中,将接种好的细胞放置在37℃培养箱继续培养约14 d,直至大部分细胞克隆数大于50时结束培养,取出6孔板,向各孔细胞中加入1 ml多聚甲醛固定1 h,磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后再向细胞中加入500 μl Giemsa染色液,染色20 min,清水洗涤3次,对各组细胞克隆数进行计数。
7. IRX1对SiHa细胞周期及凋亡影响检测
采用流式细胞术。转染后的各组SiHa细胞以胰酶消化,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化,离心收集细胞,调整细胞悬液密度为3×105/ml,加入预冷的70%的乙醇对细胞进行固定。离心弃上清,加入预冷的PBS 200 μl洗涤细胞2次。向细胞中加入20 μl RNA酶,置37 ℃下孵育30 min,再加入400 μl 碘化丙啶（PI）染液,置于冰上,避光反应15 min,流式细胞仪检测细胞周期比例。另收集转染后的各组SiHa细胞,加入100 μl结合缓冲液重悬细胞,再向细胞悬液中加入异硫氰酸荧光素Annexin V-FITC和PI各5 μl,
混匀后避光孵育30 min,1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
混匀后避光孵育30 min,1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
三、统计学处理
采用SPSS 21.0对数据进行统计分析。数据均以$\bar{x} \pm s $表示,所有试验均重复3次。多组间差异比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、慢病毒载体介导转染建立稳定沉默IRX1基因的SiHa细胞株
二、IRX1对SiHa细胞增殖的影响
从转染48 h开始,sh-IRX1组SiHa细胞OD值均低于Control组和sh-NC组（P均< 0.05）,而Control组和sh-NC组SiHa细胞在各个时间点OD值比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。另外,sh-IRX1组SiHa细胞克隆形成数均少于Control组和sh-NC组（P均< 0.05）,而Control组和sh-NC组SiHa细胞克隆形成数比较差异无统计学意义（P > 0.05）,见表2。
表2 3组SiHa细胞OD值和克隆形成数比较（$\bar{x} \pm s $,n = 6） |
| 组 别 | OD值 | 克隆形成数 | ||
|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 72 h | ||
| Control组 | 0.24±0.02 | 0.62±0.06 | 0.90±0.09 | 96.6±10.0 |
| sh-NC组 | 0.25±0.03 | 0.63±0.06 | 0.92±0.09 | 94.3±10.1 |
| sh-IRX1组 | 0.22±0.02 | 0.35±0.04ab | 0.48±0.05ab | 28.4±3.7ab |
| F值 | 2.471 | 51.614 | 59.423 | 124.616 |
| P值 | 0.118 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
注：与Control组比较,aP < 0.05;与sh-NC组比较,bP < 0.05 |
三、IRX1对SiHa细胞周期的影响
流式细胞术检测结果显示,sh-IRX1组G0/G1期细胞百分比均高于Control组和sh-NC组（P均< 0.05）,S期和G2/M期细胞百分比均低于sh-IRX1组（P均< 0.05）,而Control组和sh-NC组各时期细胞百分比比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见表3。
表3 3组SiHa各周期细胞比例比较（$\bar{x} \pm s $,n = 6）单位：% |
| 组 别 | G0/G1期 | S期 | G2/M期 |
|---|---|---|---|
| Control组 | 48.85±3.12 | 39.44±3.02 | 11.71±1.22 |
| sh-NC组 | 48.56±3.24 | 38.69±3.01 | 12.75±1.05 |
| sh-IRX1组 | 62.80±5.75ab | 28.69±2.14ab | 8.51±1.14ab |
| F值 | 22.374 | 28.487 | 22.593 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
注：与Control组比较,aP < 0.05;与sh-NC组比较,bP < 0.05 |
四、IRX1对SiHa细胞凋亡的影响
sh-IRX1组SiHa细胞凋亡率为（21.94± 3.24）%,均高于Control组的（3.36±0.55）%和sh-NC组的（3.82±0.57）%,P均< 0.05。Control组和sh-NC组SiHa细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P > 0.05）,见图2。
五、IRX1对SiHa细胞中蛋白表达水平的影响
表4 3组SiHa细胞中蛋白相对表达水平比较（$\bar{x} \pm s $,n = 6） |
| 组 别 | PCNA | Cyclin D1 | BAX | BCL-2 |
|---|---|---|---|---|
| Control组 | 0.26±0.03 | 0.98±0.10 | 0.58±0.06 | 0.88±0.09 |
| sh-NC组 | 0.25±0.02 | 0.99±0.10 | 0.57±0.06 | 0.90±0.09 |
| sh-IRX1组 | 0.09±0.01ab | 0.24±0.02ab | 1.16±0.12ab | 0.16±0.02ab |
| F值 | 117.000 | 163.265 | 95.083 | 192.723 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
注：与Control组比较,aP < 0.05;与sh-NC组比较,bP < 0.05 |
讨论
既往研究显示,IRX1在多种肿瘤中起抑癌基因或促癌基因的作用[18]。Liu等[19]研究表明,蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）作为IRX1的主要上游调节剂通过诱导IRX1的表观遗传沉默促进胃癌细胞的致瘤性和转移。IRX1 mRNA在原发性肝癌组织中的表达量显著高于相应癌旁组织,IRX1基因的异常高表达可促进肝癌细胞凋亡,抑制细胞生长[20]。以上这些研究显示出IRX1基因的抑癌作用。然而,在Lu等[21]的研究中,IRX1在人骨肉瘤细胞系和临床骨肉瘤组织中过表达,体外研究显示,IRX1通过上调CXCL14/NF-κB信号传导通路促进细胞体外迁移和侵袭。另一项研究显示,IRX1在胶质瘤组织中的表达高于正常脑组织及癌旁组织,且与胶质瘤的恶性程度呈正相关[22]。Zhang等[23]报道指出,在胶质瘤组织和U373、LN229和T98G细胞中IRX1的表达升高,其表达量与神经胶质瘤患者的总体存活率呈正相关,提示基因可能在神经胶质瘤中表现出致癌作用。这些研究显示出IRX1基因的促癌作用,并提示IRX1在不同肿瘤中发挥不同作用可能与其表达量有关。何杨等[17]指出,IRX1在宫颈癌组织和细胞株中的表达显著升高,提示IRX1可能促进宫颈癌的发生和发展。基于以往研究结果,本研究通过慢病毒载体转染IRX1 shRNA至宫颈癌SiHa细胞,探究沉默IRX1基因对SiHa细胞增殖和凋亡的影响。
本研究显示,宫颈癌SiHa细胞中IRX1 mRNA和蛋白表达水平均降低,表明稳定沉默IRX1基因的SiHa细胞株构建成功。CCK-8和克隆形成试验显示,沉默IRX1基因能够抑制SiHa细胞增殖能力。这与Yu等[24]关于IRX1能够调节牙釉质外上皮和肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖和分化的研究类似。PCNA是增殖细胞核抗原,仅存在于增殖细胞和肿瘤细胞中,与细胞中DNA合成密切相关,且能够启动细胞增殖,是反映细胞处于增殖状态的良好指标[25]。Cyclin D1是一类细胞周期蛋白,其在进化上高度保守,能够促进细胞增殖,且在细胞周期调控中发挥关键作用[26]。本研究显示,沉默IRX1基因后SiHa细胞中PCNA和Cyclin D1蛋白表达下调,提示沉默IRX1对SiHa细胞增殖抑制作用可能与下调PCNA和Cyclin D1的表达有关。此外流式细胞仪检测结果显示,沉默IRX1基因能够阻滞细胞周期进程并促进细胞凋亡。BAX和BCL-2属于BCL-2蛋白家族,在细胞凋亡过程中扮演重要角色[27]。BAX是主要的凋亡促进因子,其编码的BAX蛋白可与BCL-2结合形成异二聚体,当BAX含量增多时可阻抑BCL-2对细胞的保护作用诱导细胞发生凋亡[28]。本研究显示,沉默IRX1基因能够上调SiHa细胞中BAX的表达,下调BCL-2的表达,表明沉默IRX1基因可能通过上调BAX的表达及下调BCL-2的表达促进SiHa细胞凋亡。
综上所述,本研究表明沉默IRX1基因能够抑制宫颈癌SiHa细胞增殖并诱导细胞凋亡,其潜在作用机制可能与调控PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2的表达有关。然而,IRX1在宫颈癌中的确切作用机制尚不清楚,仍有待进一步探究。随着对IRX1的不断深入了解,相信IRX1有可能成为宫颈癌诊断和治疗的潜在作用靶点。