根据全球癌症统计数据显示,肝细胞癌（肝癌）是2018年全球第六大最常见的恶性肿瘤,也是世界上第四致命的恶性肿瘤[1]。在2015年,中国大约有466 100例新的肝癌病例发生,死亡病例约达422 100例[2]。尽管外科手术技术和综合治疗方法不断改进,但肝癌的预后仍不尽如人意。近年来,肝癌分子标志物的发现和应用加深了我们对肝癌发病机制的认识。但是,目前尚没有显著有效的生物标志物用于肝癌分子靶向治疗。突触融合蛋白6（STX6）是可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白家族的一员,可通过参与多种肿瘤相关蛋白的囊泡运输,从而影响肿瘤发生发展。目前已有多项研究显示STX6在肾细胞癌、食管鳞状细胞癌（ESCC）等多种肿瘤组织中明显高表达,STX6已被证实为潜在的致癌基因。然而STX6与肝癌的关系尚未有相关研究报道,为此,本研究分析STX6在肝癌组织和细胞中的蛋白及mRNA表达水平,探讨STX6的表达与肝癌患者临床病理参数的关系,评估STX6在肝癌预后评估中的价值。
材料与方法
一、标本来源
58例肝癌组织和癌旁正常肝组织标本来源于中山大学附属第三医院2003年1月至2007年12月行肝癌手术切除术的患者,其中男53例、女5例,年龄（52±9）岁,随访时间2个月 ~ 9年。患者的手术日期至最后随访时间或死亡时间的时间长度作为患者的生存时间。
二、肝癌大样本数据的获取
通过美国肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库下载371例肝细胞癌患者STX6表达数据及临床资料,并比较该大样本数据中肿瘤组织和肝癌旁组织STX6 mRNA表达水平,分析STX6转录水平与临床病理特征的相关性。最后以STX6 mRNA表达量的中位值将肝癌患者分为STX6高表达组和STX6低表达组,分析STX6对肝癌患者的预后价值。
三、 细胞系和细胞培养
研究中所用到的细胞系包括人正常肝细胞LO2,人肝癌细胞系[HepG2（G2）、Huh7（Huh）、Hep3B（3B）、Bel7404（7404）、MHCC97H（97H）、SMMC7721（7721）、QGY7703（QGY）],均购于中国科学院细胞库,LO2细胞和其他人肝癌细胞系培养分别使用Gibco®RPMI 1640培养基（Invitrogen公司）,DMEM高糖培养基（Invitrogen公司）,添加10%胎牛血清（Gibco公司）和1%青霉素-链霉素（Invitrogen公司）,于37℃、5%湿度的CO2培养箱中培养。细胞在80%~90%融合后传代培养。
四、蛋白免疫印迹法
本研究使用蛋白免疫印迹法检测了8例肝癌患者中肿瘤组织和肝癌旁组织STX6表达差异,操作如下：①蛋白提取按照全蛋白提取试剂盒（KGP250;凯基生物）说明书进行肝癌组织和肝癌细胞的蛋白提取。并采用BCA试剂盒（BCA-23225;凯基生物）测定蛋白浓度,蛋白放置于-80℃冰箱保存备用;②电泳采用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（KGP113;凯基生物）制备10%的分离胶和浓缩胶,上样待测样品和分子量标志物Marker,先在60 ~ 90 V电压下电泳至分离胶,改换120 V电压下至电泳结束;③转膜,恒流300 mA条件下,转膜1.5 h;④检测目的蛋白,采用磷酸盐吐温缓冲液洗膜后,5%脱脂牛奶封闭2 h。洗膜3次后,孵育STX6抗体（ab140607;Abcam公司）置于4 ℃环境过夜。洗膜3次,室温下孵育二抗（KGAA35;凯基生物）1 h。洗膜3次,于暗室进行曝光显影,分析目的蛋白的相对表达量。
五、免疫组织化学染色（免疫组化）
按照Dako免疫组化试剂盒（K5007;Dako）说明书中步骤进行STX6染色,在显微镜下观察肝癌组织和肝癌旁组织的染色结果差异。
六、实时定量PCR
使用RNA快速提取试剂盒（RN001;奕杉生物）提取58例新鲜冷冻肝癌组织样本及肝癌旁组织样本的总RNA,并使用Roche Tra-nscriptor cDNA Synth.Kit2逆转录试剂盒将上述RNA逆转录成模板DNA。β-actin作为对照管家基因。引物如下：STX6上游5’-AGAGCAAGAGGGTTCTGCATTG-3’,下游5’-TGGTACAGCAACATCAAGTCGG-3’,β-actin上游5’-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3’,下游5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’。Roche SYBR Green试剂作为通用染料进行实时荧光定量PCR检测。冰上避光用96孔板配制PCR反应体系（总体积10 μl）：DEPC水3 μl,SYBR Green I Master 5 μl,STX 6及β-actin上游引物各0.5 μl、下游引物各0.5 μl。将96孔板于Roche LightCycler® 480 PCR仪中进行反应,设置程序为： 95℃ 5 min,然后95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s循环40次,最后95℃ 5 s、65℃ 1 min、97℃ 5 min、40℃ 10 s。采用2–△△Ct方法分析组织样本间STX6 mRNA相对表达量。计算公式：2–△△Ct,△Ct = CtSTX6-Ctβ-actin。以STX6 mRNA表达量的中位值,将肝癌患者分为STX6高表达组和STX6低表达组。
七、统计学处理
应用SPSS 22.0处理数据。计量资料以$\bar{x}±s$表示,肝癌组织及肝癌旁组织的表达差异采用配对t检验,低表达组与高表达组的比较采用成组t检验,不同临床分期及病理分期间的表达差异采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。计量资料以例（%）表示,无序分类资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法;等级资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验。构建Kaplan-Meier生存分析模型评估STX6高表达组和低表达组的生存率,组间比较采用log-rank检验,最后通过Cox回归分析肝癌患者预后的影响因素,其中多因素回归分析采用Forward LR法。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、TCGA数据库的基因芯片及临床数据分析
371例肝癌的STX6 mRNA表达水平高于肝癌旁组织（P < 0.001）,并且肝癌患者STX6 mRNA表达水平随肿瘤临床分期（Ⅰ ~ Ⅲ期）及病理分期（G1 ~ G3期）升高而升高（总体及组间两两比较P均< 0.05）,肝癌患者STX6 mRNA表达水平在肿瘤临床分期Ⅲ期和Ⅳ期及病理分期G3期和G4期间比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。以STX6 mRNA表达水平的中位值为临界值,将肝癌患者分为STX6高表达组和STX6低表达组,Kaplan-Meier分析显示,STX6 mRNA高表达组肝癌患者总生存率低于STX6 mRNA低表达组（P = 0.012）,见图1。
二、肝癌组织和肝癌旁组织分析结果
58例肝癌组织中STX6 mRNA表达水平高于肝癌旁组织（P = 0.001）,见图1A。进一步分析显示,STX6高表达组的肿瘤分化程度较低、肿瘤较大、美国癌症联合委员会（AJCC）分期较高（P 均< 0.05）,见表1。蛋白免疫印迹显示,肝癌组织中STX6蛋白表达较肝癌旁组织升高（8例标本中有6例提示高表达）,见图2B;在7种不同肝癌细胞系细胞中的STX6蛋白表达均较人正常肝细胞（LO2）升高,见图2C。免疫组化也显示STX6在肝癌组织中的表达高于肝癌旁组织,并且主要在细胞质中表达,见图2D。以STX6免疫组化结果将58例患者分为STX6高表达组和STX6低表达组,通过Kaplan-Meier分析方法绘制生存曲线,结果显示STX6高表达组肝癌患者的整体生存率低于低表达组（P = 0.039）,见图2E。
表1 58例肝癌组织STX6 mRNA表达水平与患者临床病理参数的关系[例（%）] |
| 项 目 | STX6 mRNA | χ2值 | P 值 | |
|---|---|---|---|---|
| 高表达（30例） | 低表达 （28例） | |||
| 性别 | - | 0.354a | ||
| 男 | 26（87） | 27（96） | ||
| 女 | 4（13） | 1（4） | ||
| 年龄 | 2.421 | 0.120 | ||
| ≥49岁 | 21（70） | 14（50） | ||
| < 49岁 | 9（30） | 14（50） | ||
| 病毒性肝炎 | - | 0.671a | ||
| HBV/HCV阴性 | 4（13） | 2（7） | ||
| HBV/HCV阳性 | 26（87） | 26（93） | ||
| 肿瘤分化程度 | -2.898 | 0.004 | ||
| 高分化 | 6（20） | 12（43） | ||
| 中分化 | 15（50） | 16（57） | ||
| 低分化 | 9（30） | 0（0） | ||
| 肿瘤大小 | 4.661 | 0.031 | ||
| ≥5 cm | 17（57） | 8（29） | ||
| < 5 cm | 13（43） | 20（71） | ||
| Child-Pugh分级 | - | 0.929a | ||
| A | 27（90） | 25（89） | ||
| B | 3（10） | 3（11） | ||
| C | 0（0） | 0（0） | ||
| AJCC肿瘤分期 | -2.546 | 0.011 | ||
| Ⅰ | 7（23） | 15（54） | ||
| Ⅱ | 10（33） | 8（29） | ||
| Ⅲ | 13（43） | 5（18） | ||
注：a Fisher确切概率法 |
三、STX6的表达与肝癌患者的预后密切相关
单因素Cox回归分析显示,肝癌切除术后总生存率的影响因素包括肿瘤分化程度、肿瘤大小、AJCC肿瘤分期以及STX6 mRNA表达水平（P均< 0.05）。多因素Cox回归分析显示,AJCC肿瘤分期（HR = 5.454,95%CI 1.825 ~ 16.297,P = 0.002）和STX6 mRNA表达水平（HR = 3.872,95%CI 1.641 ~ 9.140,P = 0.002）与肝癌术后总生存率密切相关,见表2。
表2 肝癌患者总生存率的影响因素分析 |
| 项 目 | 单因素分析 | 多因素分析 | ||
|---|---|---|---|---|
| HR(95%CI) | P值 | HR(95%CI) | P值 | |
| 性别 | ||||
| 男 | 0.989(0.300 ~ 3.256) | 0.985 | - | - |
| 女 | 参照组 | |||
| 年龄 | ||||
| ≥49岁 | 0.767(0.381 ~ 1.544) | 0.458 | - | - |
| <49岁 | 参照组 | |||
| 病毒性肝炎 | ||||
| HBV/HCV阴性 | 5.158（0.703 ~ 37.834） | 0.107 | - | - |
| HBV/HCV阳性 | 参照组 | |||
| 肿瘤分化程度 | 0.001 | - | - | |
| 高分化 | 3.380(1.258 ~ 9.083) | |||
| 中分化 | 9.258(2.923 ~ 29.323) | |||
| 低分化 | 参照组 | |||
| 肿瘤大小 | ||||
| ≥5 cm | 2.579(1.191 ~ 5.584) | |||
| <5 cm | 参照组 | |||
| Child-Pugh分级 | ||||
| A | 1.678(0.645 ~ 4.366) | 0.289 | - | - |
| B | 参照组 | |||
| AJCC肿瘤分期 | < 0.001 | < 0.001 | ||
| Ⅰ | 3.025(1.125 ~ 8.137) | 5.454(1.825 ~ 16.297) | 0.002 | |
| Ⅱ | 8.054(3.224~20.124) | 8.083(3.151 ~ 20.732) | < 0.001 | |
| Ⅲ | 参照组 | 参照组 | ||
| STX6 | ||||
| 低表达 | 2.999(1.458 ~ 6.169) | 0.003 | 3.872(1.641 ~ 9.140) | 0.002 |
| 高表达 | 参照组 | 参照组 | ||
讨论
可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）是参与囊泡运输的一类膜蛋白,在囊泡运输过程中,SNARE复合物可以将囊泡和靶区室膜锚定在一起,从而促进囊泡和靶膜融合[7,8]。STX6是SNARE蛋白家族的一员,主要存在于反式高尔基体膜上,调节多种细胞内膜转运活动,如内吞作用、循环、顺行和逆行转运[9,10]。例如,STX6可参与整合素的传递和整合素引发的黏附斑激酶的激活[11]。整合素属于细胞黏附受体,它可作为信号分子、细胞机械传感器和细胞迁移中的关键分子,参与恶性肿瘤从原发到侵袭转移的过程[12,13,14]。有研究显示,STX6可作为p53家族（p53、p63和p73）潜在的靶点,是p53家族调控细胞黏附和细胞存活的效应体。STX6敲低后可抑制细胞黏附,并导致细胞周期停滞和细胞凋亡,而且下调p53表达可以减弱STX6敲低后对人乳腺癌细胞（MCF7）增殖的抑制效果[15]。此外,有报道抑制STX6功能可干扰血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）向质膜的运输,并促进了VEGFR2在溶酶体降解,从而减少血管内皮生长因子（VEGF）诱导的肿瘤细胞增殖、细胞迁移和血管形成[16]。可见STX6在肿瘤的发生、发展中可能扮演着重要角色。
目前已有相关研究表明STX6与多种恶性肿瘤的发生发展存在密切联系。Du等[17]的研究显示,STX6在食管癌组织中高表达,沉默食管癌细胞STX6表达可通过p53依赖的方式抑制食管癌细胞的存活和增殖,并且通过抑制整合素的运输进而抑制食管癌细胞的迁移。在肾细胞癌中STX6蛋白表达明显升高,且沉默STX6后肾癌ACHN细胞活力降低[18]。此外,有研究显示STX6可调控化学治疗耐药相关分子的储存和运输,在前列腺癌耐恩杂鲁胺细胞株（C4‐2B）中STX6以及外泌体高表达,敲低STX6后前列腺癌细胞外泌体分泌下降,并且增加了前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的敏感度,提高前列腺癌的化学治疗效果[19]。在人卵巢癌细胞系A2780细胞中,STX6和囊泡相关膜蛋白4与P型ATP酶膜蛋白共定位,有助顺铂从高尔基体到质膜的分泌性囊泡运输,从而增强卵巢癌细胞对顺铂的耐药性[20]。因此,STX6可受关键癌基因的调控,调节肿瘤相关分子的胞内运输,以及通过介导胞外泌体分泌促进耐药而参与疾病的进展。本研究中,STX6在肝癌组织及肝癌细胞系细胞中高表达,并且高表达STX6患者的预后较低表达STX6患者差,STX6不仅与肝癌患者临床病理参数（例如肿瘤大小、AJCC临床分期、肿瘤分化程度）等密切相关,还与肝癌患者的生存预后密切相关。