材料与方法
一、材料
1. 实验动物
SPF级SD大鼠50只,雌雄各半,6 ~ 8周龄,体质量180 ~ 220 g,购自河南省实验动物中心[SCXK（豫）2017-0001],饲养在河南省实验动物中心实验室独立动物房[SYXK（豫）2016-0002]。实验动物及饲养条件符合《实验动物管理条件》要求。饲养条件：室温（22±1）℃,湿度（50±10）%,每天定时换气,保持12 h∶12 h光暗照明,食水不限。研究方案获伦理委员会批准。
2. 主要试剂与仪器
柚皮素（Sigma-Aldrich,批号：W530098）,阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司,批号：BJ49401）,HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）,兔IgG-免疫组织化学（组化）试剂盒SABC即用型（武汉博士德生物工程有限公司）,血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔源单克隆抗体,羊抗兔二抗（美国CST公司）,双板垂直电泳仪（北京六一仪器厂,型号：DYCZ-24KS）,IX53显微镜（日本奥林巴斯）,G：BOX多功能凝胶成像系统（Syngene）,多普勒超声仪（美国Beckman公司）,Multiskan MK3酶标仪（Thermo Fisher Scientific）,TGL16MB高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）。
二、实验方法
1. 分组与造模
将50只SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组,每组10只。模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组大鼠通过结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,造模参考文献[8]的方法：大鼠腹腔注射10 %水合氯醛麻醉,以仰卧位固定于手术台,经口行气管插管,接入呼吸机辅助呼吸。胸前区备皮消毒,在胸骨左侧第3、4肋间开胸,暴露心脏,在心脏前降支下2 ~ 3 mm处结扎冠状动脉,可见局部心肌由红色变为白色,收缩减弱,将心脏放回胸腔,缝合伤口,若心电图可见Ⅱ导联ST段较手术前抬高0.2 mV以上则视为造模成功。经观察,模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组大鼠均造模成功。假手术组大鼠仅开胸,不做冠状动脉结扎。从造模当天开始肌肉注射4万单位青霉素预防伤口感染,每日1次,连续3 d。造模完成后,各组大鼠均存活,存活率为100%。
2. 给药方法
造模24 h后开始给药。结合文献[9]及预实验的结果,我们分别灌胃给予柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组大鼠100 mg/（kg·d）和50 mg/（kg·d）柚皮素（药物采用0.5% CMC-Na混合均匀）,阿司匹林组大鼠灌胃100 mg/（kg·d）阿司匹林肠溶片（药物研磨后溶于生理盐水）,假手术组和模型组大鼠灌胃20 ml/kg生理盐水,每日1次,连续4周。
3. 心功能指标检测
大鼠心功能指标在最后一次给药后2 h检测,检测通过多普勒超声仪完成,检测指标包括LVEF、左室短轴缩短率（LVFS）、左室收缩末期内径（LVESD）和左室舒张末期内径（LVEDD）,连续检测3个心动周期,取平均值作为检测数据。
4. HE染色
处死大鼠,分离心脏,其中5只大鼠心脏放置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于HE染色、Masson染色和免疫组化染色,另5只大鼠心脏组织冻存于-80℃超低温冰箱中,用于蛋白免疫印迹法检测。将大鼠心脏组织在4%多聚甲醛溶液中固定48 h,蒸馏水清洗,然后置于50%、70%、85%、95%、100%的乙醇中进行梯度脱水,制作组织蜡块,冰上预冷切片（厚度为4 μm）,二甲苯脱蜡30 min,在95%、80%的乙醇及蒸馏水中复水,使用苏木精和伊红染液分别染细胞核和细胞质,脱水、透明后用中性树胶封片,置于显微镜下观察大鼠心脏组织病理变化。
5. Masson染色
取使用4%多聚甲醛溶液固定的大鼠心脏组织,切片、脱蜡、复水过程同上。Weigert 铁苏木素染色5 min,酸性乙醇分化5 ~ 15 s水洗,Masson蓝化液返蓝3 ~ 5 min水洗,丽春红酸性品红染色液染色5 ~ 10 min,弱酸工作液（蒸馏水∶弱酸溶液= 2∶1）洗涤1 min,磷钼酸溶液染色1 min,弱酸工作液洗涤1 min,苯胺蓝染色1 ~ 2 min,弱酸工作液洗涤1 min,95%乙醇和无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,置于显微镜下观察心脏组织纤维化情况。
6. 免疫组化染色
取大鼠心脏组织制作石蜡切片,方法同上。将组织切片60℃烤片2 h,二甲苯脱蜡2 h,置于100%、95%、90%、80%的乙醇中复水,随后进行抗原修复、封闭,滴加用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的CD31兔源单克隆抗体（稀释比例为1∶100）,放入湿盒中,盖上盖子,置4℃冰箱过夜,第2日37℃孵育羊抗兔二抗0.5 h,PBS冲洗后加DAB显色液,苏木精染细胞核,60%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脱水,中性树胶封片,置于显微镜下观察。CD31阳性细胞可被染成棕黄色,主要分布于梗死周边范围,梗死区少见。选择梗死周边区域,随机选取5个视野,计算CD31呈阳性的微血管数量,取平均值,即为微血管密度（MVD）。使用Image-Pro Plus 6. 0分析CD31阳性表达的光密度值（IOD）,IOD值越大代表阳性表达率越高。
7. 蛋白免疫印迹法
从-80 ℃中取大鼠心脏组织,冰上研磨,离心取沉淀,加入裂解液提取肺组织蛋白,BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,加入loading buffer,在EP管中混匀后置于沸水中煮沸5 min使蛋白变性。配置15 %的分离胶和5 %的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳,上样后80 V电泳2 h,60 V转膜2 h,5%脱脂奶粉封闭2 h,随后将条带放入10 ml VEGF、bFGF兔源一抗稀释液中,稀释比例均为1∶1000,4℃过夜,第2日用TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2000）37℃孵育2 h,洗膜,滴加发光液,置凝胶成像系统显影。内参蛋白为GAPDH,Image J软件分析各个蛋白对应的灰度值,计算蛋白的相对表达量,蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。
三、统计学处理
应用SPSS 25.0 分析数据,实验重复3次,计量资料以$\bar{x}±s$表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、各组大鼠心功能指标比较
假手术组、模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组5组间LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD指标比较,差异均有统计学意义（F = 21.62、25.67、18.36、15.48,P均< 0.01）。与假手术组比较,模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组LVEF和LVFS均降低,LVESD和LVEDD均增加,差异均有统计学意义（P均< 0.05）;与模型组比较,阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组LVEF和LVFS增加,LVESD和LVEDD降低,差异均有统计学意义（P均< 0.05）;与阿司匹林组比较,柚皮素高剂量组心功能指标差异均无统计学意义（P均> 0.05）,柚皮素低剂量组LVEF和LVFS降低,LVESD和LVEDD增加,差异均有统计学意义（P均< 0.05）;与柚皮素高剂量组比较,柚皮素低剂量组LVEF和LVFS降低,LVESD和LVEDD增加,差异均有统计学意义（P均< 0.05）,见表1。
表1 各组大鼠心功能指标比较（$\bar{x}±s$,n = 10） |
| 组 别 | LVEF（%） | LVFS（%） | LVESD（mm） | LVEDD（mm） |
|---|---|---|---|---|
| 假手术组 | 78.70±4.88 | 42.50±3.01 | 4.77±0.88 | 6.95±0.98 |
| 模型组 | 38.29±2.11a | 16.55±2.12a | 9.18±1.36a | 10.44±1.41a |
| 阿司匹林组 | 54.33±3.27ab | 24.85±2.54ab | 7.06±1.18ab | 8.74±1.33ab |
| 柚皮素高剂量组 | 54.98±3.02ab | 24.51±2.68ab | 7.18±1.09ab | 8.69±1.29ab |
| 柚皮素低剂量组 | 49.67±2.74abcd | 21.75±2.02abcd | 8.11±1.21abcd | 9.35±1.15acd |
注：与假手术组比较,a P < 0.05;与模型组比较,b P < 0.05;与阿司匹林组比较,c P < 0.05;与柚皮素高剂量组比较,d P < 0.05 |
二、HE染色观察大鼠心肌组织形态变化
HE染色结果显示,假手术组心肌组织结构正常、完整,心肌细胞分布均匀、有序,轮廓清晰可见,胞核与胞质边缘分明,血管管腔完整;与假手术组比较,模型组心肌组织则呈现着色较浅、组织排列紊乱、细胞轮廓不清晰和细胞破碎现象,伴有炎症细胞浸润;与模型组比较,柚皮素高剂量组心肌组织排列较为整齐,着色均匀,有少量炎症细胞浸润,血管管腔完整度较好,但阿司匹林组和柚皮素低剂量组心肌组织仍存在一定程度排列紊乱和心肌细胞核质不清晰的现象,整体着色较浅;见图1。
三、Masson染色观察大鼠心肌胶原组织变化
四、各组大鼠免疫组化CD31染色及MVD比较
表2 各组大鼠IOD、MVD、VEGF、bFGF比较（$\bar{x}±s$,n = 10） |
| 组 别 | IOD | MVD（个） | VEGF蛋白表达水平 | bFGF蛋白表达水平 |
|---|---|---|---|---|
| 假手术组 | 5.89±0.54 | 2.41±0.22 | 0.17±0.03 | 0.15±0.02 |
| 模型组 | 10.44±0.67a | 4.98±0.39a | 0.30±0.04a | 0.26±0.03a |
| 阿司匹林组 | 13.72±0.58ab | 5.68±0.52a | 0.81±0.07ab | 0.69±0.05ab |
| 柚皮素高剂量组 | 50.96±0.91abc | 10.36±0.55abc | 1.08±0.09abc | 1.05±0.08abc |
| 柚皮素低剂量组 | 19.37±0.87abcd | 7.99±0.39abcd | 0.77±0.08abd | 0.75±0.08abd |
注：与假手术组比较,a P < 0.05;与模型组比较,b P < 0.05;与阿司匹林组比较,c P < 0.05;与柚皮素高剂量组比较,d P < 0.05 |
五、各组大鼠心肌组织VEGF、bFGF蛋白表达水平比较
讨论
LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD是评价心脏功能的常用指标。本研究结果显示,与假手术组比较,模型组LVEF和LVFS均降低,LVESD和LVEDD均增加,与模型组比较,阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组LVEF和LVFS增加,LVESD和LVEDD降低,表明心肌梗死后大鼠的心功能降低,出现明显的心室扩张和重构,阿司匹林、高剂量和低剂量的柚皮素处理后可改善大鼠的心脏功能,减轻心肌梗死后出现的失代偿性心室扩张。心肌细胞属于终末细胞,当发生心肌梗死时会造成不可逆转的组织缺血坏死,从而诱发机体产生自我保护反应,包括早期无菌性炎症反应和修复期成纤维细胞增殖、瘢痕及血管形成等活动,然而,持续的炎症损伤和过度的修复反而加剧细胞死亡和心肌收缩功能障碍,不利于心功能的改善[15,16]。本研究采用HE染色和Masson染色观察各组大鼠心肌梗死后心肌组织病理生理学改变,结果显示假手术组心肌组织结构正常、完整,心肌细胞分布均匀、有序,轮廓清晰可见,胞核与胞质边缘分明,血管管腔完整,仅部分血管周围有少量呈蓝色的胶原组织;与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织排列紊乱、细胞轮廓不清晰,呈紫红色的心肌组织明显减少,存在大量呈蓝色的胶原纤维;与模型组比较,柚皮素高剂量组心肌组织排列较为整齐,血管管腔完整度较好,组织形态优于阿司匹林组和柚皮素低剂量组,Masson染色显示柚皮素高剂量组和阿司匹林组蓝色胶原纤维大量减少,但柚皮素低剂量组仍存在较多的蓝色胶原纤维组织,组织分布相对较紊乱,表明一定剂量的柚皮素能够抑制心肌梗死导致的组织损伤,减轻心肌组织胶原纤维的沉积。
CD31是内皮细胞的特异性标志物,在评价血管新生情况时多采用CD31免疫组织化学染色来统计MVD数量,以此反映血管的生成情况[17]。本研究结果显示,与假手术组比较,模型组CD31表达水平和MVD数量增加,与模型组比较,阿司匹林及高剂量和低剂量的柚皮素均可增加心肌组织CD31表达水平和MVD数量,其中柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组CD31表达水平和MVD数量高于阿司匹林组,表明柚皮素能够显著增加大鼠心肌梗死后心梗边缘区域CD31的表达,有效促进血管新生。VEGF是特异性最高、作用最强的促血管生成细胞因子,能够特异性作用于血管内皮细胞,促进细胞增殖、出芽、迁移和血管形成过程,已被证明可促进缺血性心脏病患者血管新生[18]。
bFGF是一种生长刺激因子,能够特异性作用于血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及神经细胞,已有研究证实,VEGF和bFGF在促进血管新生过程中有明显的协同效应[19]。本研究结果显示,模型组VEGF、bFGF蛋白表达水平高于假手术组,表明大鼠心肌梗死后,机体出现代偿反应;与模型组比较,阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组VEGF、bFGF蛋白表达水平增加,其中柚皮素高剂量组VEGF、bFGF蛋白表达水平高于阿司匹林组和柚皮素低剂量组,表明柚皮素促进血管新生的作用可能与VEGF、bFGF蛋白表达水平升高有关。
综上所述,柚皮素能够改善心肌梗死大鼠的心功能,减轻心肌梗死后的组织损伤和胶原沉积,有效促进血管新生,其作用机制可能与VEGF、bFGF蛋白表达水平升高有关。