材料与方法
一、实验动物
无特定病原体（SPF）C57BL/6b雌鼠10只,8 ~ 9周龄。所有小鼠饲养于中山大学附属第三医院实验动物中心,保持室温25℃,光暗周期12 h/12 h,饲养期间小鼠自由进食饮水。本动物实验伦理经中山大学实验动物管理与使用委员会审批通过（IACG-F318-1103）。
二、实验试剂及仪器
1. 主要试剂及抗体
F12培养液（Gibco）、乙醇（Sigma, 美国）、棕榈酸（Sigma, 美国）、GRP78（Proteintech, 中国）、ATF4（Proteintech, 中国）、CHOP（Proteintech, 中国）、β-actin（Sigma, 美国）、DAB显色液（Vector）,HE染液（雷根生物）;TUNEL试剂盒（塞维尔,中国）。AML12小鼠正常肝细胞为中山大学附属第三医院消化内科实验室保有细胞。
2.主要仪器
显微镜（Leica,Germany）,SDS-PAGE电泳槽（BIO-RAD, US）,转膜仪（BIO-RAD, US）,PCR 仪（Las）,Nanodrop 2000微量紫外分光光度计（Thermo Scientific, US）,低温高速冷冻离心机（Thermo Scientific, US）等。
三、实验方法
1. 酒精性脂肪肝小鼠动物模型建立
选用8 ~ 9周龄的C57BJ/6L背景的雌性小鼠,将10只小鼠随机分为对照组和模型组,每组5只小鼠。予含Lieber-DeCarli的对照饮食或酒精饮食持续喂养15 d,第16日模型组予酒精灌胃溶液（5 g/kg）,对照组予麦芽糖灌胃溶液（9 g/kg）禁食8 h后收集小鼠血液及肝组织。
2. HE染色
将制备好的蜡块预冷后进行切片,经脱蜡和梯度水化之后,滴加苏木素染核2 min,蒸馏水冲洗,于磷酸盐缓冲液（PBS）中返蓝,之后用伊红染色30 s,蒸馏水冲洗后在显微镜下观察染色效果,中性树胶封片。
3. 油红染色
取冰冻切片于蒸馏水中充分洗涤,加入油红工作液染1 h,避光密封。水洗后苏木素染核并用中性树胶封片,显微镜下观察拍照。
4. 免疫组织化学染色
将制备好的蜡块遇冷后进行切片,经脱蜡和梯度水化后室温下静置于3%双氧水中作用10 min。将玻片放入pH为9.0的柠檬酸钠缓冲液中高压热修复3 min,待室温冷却后取出玻片,于室温下牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min,分别加入对应一抗4℃敷育过夜,PBS冲洗5 min后滴加二抗（1;300）,37℃孵育2 h,PBS冲洗后滴加二甲基联苯胺（DAB）显色,于蒸馏水中终止反应,苏木素染核后用中性树胶封片。显微镜下观察拍照。
5. 蛋白免疫印迹法
根据总蛋白提取裂解液说明书按步骤操作,取适量蛋白样本进行电泳,应用转膜仪将蛋白印迹转移至硝酸纤维素膜上,用5%牛奶封闭1 h,分别加入对应一抗后4℃敷育过夜,三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液（TBST）洗涤10 min,滴加二抗（1;5000）室温孵育2 h,TBST洗涤15 min,化学发光法发光显像,采用Image J图像分析软件进行结果分析。
6. AML小鼠正常肝细胞培养及处理
将细胞接种于6孔板中,用含10%胎牛血清的F12培养基培养,分组如下：空白对照组（细胞正常培养,不予任何处理）、50 m[mol/L（M）]酒精+250 μM棕榈酸组、100 mM酒精+250 μM棕榈酸组、200 mM酒精+250 μM棕榈酸组、200 mM酒精+250 μM棕榈酸组+ GSK2606414抑制剂组（在加入酒精及棕榈酸前30 min加入1 μM GSK2606414预处理）。继续孵育24 h后行相关检测。
7. 实时定量PCR法
根据RNA快速提取试剂盒说明书提取组织总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度与浓度,逆转录后测定目的基因。
8. TUNEL
选取空白对照组、200 mM酒精+250 μM棕榈酸组、200 mM酒精+250 μM棕榈酸组+GSK2606414抑制剂组,根据塞维尔公司的TUNEL产品说明书进行操作,检测3组凋亡细胞,DAPI显色后细胞核呈蓝色,显微镜下观察细胞凋亡情况。
四、统计学处理
应用SPSS 23.0和GraphPad prism 8.0软件进行统计学分析及作图。正态分布数据均以$\bar{x}±s$表示, 2组间比较采用两独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用Dunnet-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、小鼠肝脏损伤的评估
模型组小鼠血清ALT、AST[（97.7±6.3）U/L,（211.0 ±15.3）U/L]水平均对高于对照组小鼠 [（23.8±2.6）U/L,（97.4±1.6）U/L],差异均有统计学意义（tALT = 10.860, tAST = 7.364,P均< 0.001）。HE染色结果显示,对照组小鼠肝组织结构清晰,肝细胞完整、条索明显且排列整齐,肝小叶结构正常。而模型组小鼠肝小叶结构紊乱,出现大量明显的脂肪空泡及炎性细胞浸润。油红染色可观察到对照组小鼠肝脏切片中无显著红色脂肪组织部分,而在模型组小鼠肝脏中可见大量红色脂肪组织,提示酒精组肝脏脂肪变性明显。以上结果表明小鼠造模成功,见图1。
二、小鼠肝脏中内质网应激表达情况
根据免疫组织化学及蛋白免疫印迹分析结果显示,模型组小鼠内质网应激相关蛋白ATF4及CHOP表达水平均高于对照组;模型组小鼠肝组织中ATF及CHOP的表达水平亦均高于对照组,差异有统计学意义（t=11.530、6.206,P均< 0.001）,见图2。
三、酒精联合棕榈酸干预AML12细胞内质网应激表达情况
使用酒精联合棕榈酸处理AML12鼠正常肝细胞24 h后,与空白对照组相比,蛋白免疫印迹法灰度分析结果显示,空白对照组 ATF4/β-actin为0.409±0.035,各处理组50、100、200 mM ATF4/β-actin依次0.858±0.047,1.17±0.041,1.040±0.128;对照组 CHOP/β-actin为0.204± 0.032,各处理组50、100、200 mM CHOP/β-actin依次为1.230±0.035,1.670±0.116,1.370±0.131。各处理组50、100、200 mM内质网应激相关蛋白ATF4及CHOP表达均高于未处理组（FATF4=20.620,FCHOP=49.570,P均< 0.001）,见图3。
四、GSK2606414抑制剂对AML12细胞内质网应激表达情况的影响
与200 mM酒精+250 μM棕榈酸组相比,200 mM酒精+250 μM棕榈酸+GSK2606414抑制剂组ATF4及CHOP蛋白表达受到抑制（tATF4=5.555,tCHOP=5.806,P均< 0.05）,见图4。
五、GSK2606414抑制剂对AML12细胞凋亡的影响
讨论
内质网应激是体内众多疾病病理过程中的重要损伤机制之一。由于外源性应激源的存在使得内质网的功能受到干扰,内质网中大量未折叠或错误折叠的蛋白成为内质网应激源,活化GRP78蛋白并选择性地激活位于内质网应激膜上的蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、ATF6及内质网核信号转导蛋白1,继而活化其相应的下游信号通路,下游分子通过调控基因转录与蛋白合成等,介导细胞的生存、损伤及死亡[10]。GSK2606414是PERK信号通路的选择性抑制剂,在发生内质网应激的细胞中给予GSK2606414处理后,可有效抑制PERK蛋白的自身磷酸化活化,继而抑制下游的eIF2 /ATF4/CHOP信号通路[11]。既往实验表明GSK2606414可以抑制棕榈酸诱导的JNK信号通路的活化和原代小鼠肝细胞的细胞凋亡[12]。在本研究中,我们选取野生基因背景的小鼠,应用NIAAA建立的慢性酒精喂养加急性酒精灌胃的模型,有效复制了酒精性脂肪肝患者中经常慢性饮酒伴随过度饮酒者的饮酒行为和慢加急性肝损伤[13,14]。Wang等[15]研究发现构建酒精加棕榈酸细胞模型相对于传统方法更有效的模拟出体外的酒精性脂肪肝模型。我们在AML12细胞实验上通过酒精协同棕榈酸共同干预,诱导细胞发生脂肪样变,也成功在体外模拟出酒精性脂肪肝损伤模型。本研究结果表明,通过病理组织观察及血清指标检测, 结果显示酒精性脂肪肝模型诱导成功,同时其内质网应激表达水平亦出现了明显的升高。接下来的细胞实验亦证明了这一点,酒精加棕榈酸处理AML12细胞后内质网应激表达情况均高于未处理组,应用GSK2606414抑制剂预处理细胞后,其内质网应激表达水平受到了抑制且细胞凋亡明显减轻,进而改善了慢性酒精性肝损伤。在酒精性肝病研究过程中能量代谢也是当下研究的热点之一,越来越多的证据表明,内质网和线粒体都是肝脏能量稳态的关键因素,肝脏的胰岛素抵抗与线粒体功能障碍,内质网应激,脂质和Ca2+稳态改变有关[16,17]。既往有研究发现内质网与线粒体之间存在物理接触的线粒体关联性内质网膜（MAM）结构是细胞中重要的相互作用之一。内质网与线粒体接触位点允许两种细胞器在功能上相互调节,从而影响各项细胞活动,如能量代谢以及细胞死亡和存活的调节[18,19]。因此本实验也为下一步酒精性肝病其他的相关机制研究提供了思路。
综上所述,我们的研究表明在酒精性脂肪肝中内质网应激表达水平升高,而GSK2606414抑制剂预处理后可明显抑制内质网应激来减轻肝细胞凋亡情况。因此,GSK2606414作为一种内质网应激的抑制剂,有望作为一种新型的靶点来治疗酒精性脂肪肝。