肝细胞癌是最常见的原发性肝癌,现已成为全球癌症相关死亡的主要原因之一[1]。肝细胞癌的主要致病因素为慢性乙型肝炎和黄曲霉毒素B1中毒,中国属于肝癌高发地区,随着慢性肝脏疾病的患病率逐年上升,肝细胞癌的发病率也将不断增加,尽管肝细胞癌的预防、检测、诊断和治疗手段取得了很大进步,但由于肝癌复杂的病理机制以及易侵袭、转移的特性,使得患者的预后仍不尽人意[2]。因此,寻找新的分子生物标志物,对肝癌具有重要的临床意义。乙酰辅酶A酰基转移酶（ACAT）,又称乙酰乙酰辅酶A硫解酶、β-酮硫解酶,在哺乳动物中存在2种亚型,分别为ACAT1和ACAT2,ACAT1位于线粒体上,ACAT2位于细胞质里[3]。线粒体ACAT1主要参与体内酮体和异亮氨酸的代谢,催化两分子乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的可逆过程,在肝内主要参与酮体生成,而在肝外组织主要参与酮体分解。ACAT1缺乏或突变是一种罕见的常染色体隐性遗传病,临床上,轻度患者无明显症状或为呕吐、腹泻、脱水等代谢性酸中毒症状,重度患者则可能出现昏迷、神经系统发育落后甚至死亡[4,5,6]。近年来,有研究者发现ACAT1在前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌中,参与了肿瘤耐药和细胞增殖过程,亦有研究者发现ACAT1的下调可能是肾透明细胞癌的保护因素[7,8,9]。可见,ACAT1基因与肿瘤的发生、发展及耐药等方面可能存在密切联系,ACAT1有望成为肿瘤治疗潜在的重要分子靶点。然而,ACAT1在肝癌中的研究鲜有报道,因此,我们将分析ACAT1在肝癌中的表达情况,评估其在肝细胞癌中的诊断、预后评估价值。
材料与方法
一、标本来源
研究中使用的76对肝癌组织和癌旁组织标本来源于2003年1月至2019年12月期间在中山大学附属第三医院行肝癌切除术的患者,所有标本术后均经过石蜡包埋、HE染色并有明确病理诊断,其中男50例、女26例。所有患者均签署知情同意书。
二、数据下载
研究中使用的371例肝癌患者（其中有50例包含癌组织和癌旁组织,其余321例仅包括癌组织）ACAT1基因测序信息及临床信息来源于美国肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库,本研究分析了上述343例（剔除临床信息不全病例后）肝癌患者肿瘤组织（n=343）和癌旁组织（n=50）ACAT1的mRNA表达水平及其与临床病理参数的相关性。最后以ACAT1的mRNA表达量中位值为界,将这343例肝癌患者分为ACAT1高表达组和ACAT1低表达组,分析ACAT1对肝癌患者的预后价值。
三、实时定量PCR
使用Trizol-RNA提取试剂（Sigma）提取76例新鲜冷冻肝癌组织样本及癌旁组织样本的总RNA,并使用Transcriptor cDNA Synth.Kit2逆转录试剂盒（罗氏）将1.0 μg总RNA逆转录成cDNA,以PCR仪（顶部加热型）65℃加热10 min,添加剩余成分后25℃10 min→55℃30 min。最后使用SYBR GREEN I MASTER（罗氏）进行实时荧光定量PCR检测（10 μl反应体系）。β-actin作为内参基因。PCR设置程序为：第一步95℃ 5 min,第二步95℃ 10 s→60℃ 20 s→72℃ 20 s 40个循环,第三步95℃ 5 s→65℃ 1 min→97℃ 5 min→40℃ 10 s。采用Log2-△△Ct （△Ct=CtACAT1-Ctβ-actin）公式算出肝癌组织与癌旁组织间ACAT1的mRNA相对表达量,以ACAT1的mRNA表达量中位值为界,将患者分为ACAT1高表达组和ACAT1低表达组。实验中使用的引物序列如下,ACAT1上游引物序列：5’-GAGGTGCTTCTGCCATGCTA-3’,ACAT1下游引物序列：5’-TGGTCACATAGGGTTGTCTCCT-3’,β-Actin上游引物序列：5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’,β-Actin下游引物序列：5’-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3’。
四、蛋白免疫印迹法
使用RIPA裂解液提取4例肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织蛋白,BCA法（Thermo scientific）测定蛋白浓度,取50 μg蛋白制备样品;将上述样品上样至10% SDS-PAGE凝胶,恒压60 V电泳30 min将样品压至分离胶,改换恒压120 V至电泳结束;随即恒压100 V下转膜90 min,将蛋白转至0.22 μm PVDF膜上;5%脱脂牛奶封闭2 h,目的条带置于ACAT1一抗稀释液中（1;1000,Abcam）,内参条带置于β-actin一抗稀释液（1; 1000,ABclonal）中4℃孵育过夜;室温孵育兔二抗（1;5000,ABclonal）1 h,最后进行化学发光检测,分析ACAT1蛋白的相对表达量。
五、统计学处理
使用GraphPad Prism 7.0处理数据。计量资料以$\bar{x}±s$表示,等级资料以例（%）表示。采用配对t检验分析TCGA数据库中50例肝癌患者癌组织与对应的癌旁组织ACAT1的表达差异,独立样本t检验从整体水平分析TCGA数据库中343例肝癌组织与50例癌旁组织ACAT1的表达差异;配对t检验分析76例肝癌患者癌组织和癌旁组织ACAT1的表达差异;ACAT1表达量与临床分期 [2017年美国癌症联合委员会（AJCC）分期标准]、病理分级间的关系采用方差分析,多重比较采用LSD-t检验;采用受试者工作特征（ROC）曲线评价ACAT1对肝癌的诊断价值;用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,组间比较用log-rank 检验;采用单因素与多因素Cox回归分析（进入法）肝癌患者预后的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、ACAT1基因TCGA数据库分析结果
在TCGA数据库所获得的343例肝癌患者中,与50例癌旁组织的正常肝组织相比,ACAT1在肝癌组织中表达下降,且具有统计学意义（P < 0.001）,见图1A。TCGA数据库所获得的50例肝癌患者中,与癌旁正常组织相比,ACAT1在肝癌组织中表达下降（P < 0.001）,见图1B。随着患者肿瘤临床分期（StageⅠ期 ~ Ⅲ期）及病理分级（G1 ~ G4级）升高,ACAT1的转录水平不断下降（总体P均< 0.001）,见图2。以ACAT1 mRNA表达水平的中位值（42.473905）为界,将患者分为ACAT1高表达组和ACAT1低表达组。Kaplan-Meier分析显示,ACAT1高表达组总生存率高于ACAT1低表达组（HR=0.437, 95% CI= 0.289 ~ 0.585,P < 0.001）,见图3。
单因素Cox回归分析显示,肝癌患者术后总生存率的影响因素包括临床分期（P < 0.001）、肿瘤T分期（P < 0.001）、ACAT1 mRNA表达量（P=0.002）,进一步多因素Cox回归分析显示,ACAT1 mRNA的表达量跟肝癌患者术后总生存率相关,是肝癌患者预后的独立危险因子（HR=0.991, 95%CI=0.982 ~ 0.999, P=0.029）,见表1。
表1 肝癌患者术后总生存率的单因素与多因素Cox回归分析 |
| 因 素 | 单因素分析 | 多因素分析 | ||
|---|---|---|---|---|
| HR（95%CI） | P值 | HR（95%CI） | P值 | |
| 年龄 | 1.010（0.995 ~ 1.025） | 0.177 | ||
| 性别 | 0.820（0.557 ~ 1.209） | 0.317 | ||
| 病理分级 | 1.121（0.868 ~ 0.446） | 0.382 | ||
| 临床分期 | 1.672（1.359 ~ 2.056） | < 0.001 | 1.024（0.433 ~ 2.422） | 0.957 |
| 肿瘤T分期 | 1.652（1.357 ~ 2.011） | < 0.001 | 1.593（0.703 ~ 3.610） | 0.265 |
| ACAT1 mRNA表达量 | 0.987（0.979 ~ 0.995） | 0.002 | 0.991（0.982 ~ 0.999） | 0.029 |
二、肝癌组织和癌旁组织mRNA和蛋白分析结果
讨论
ACAT1是位于细胞线粒体上的酮体代谢酶,催化酮生成和酮解过程中乙酰辅酶A和两个乙酰辅酶A分子之间的可逆转换。在肝脏的酮生成过程中,ACAT1催化两分子乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A,而在肝外组织的酮分解过程中,ACAT1促进乙酰乙酰辅酶A分解为两分子乙酰辅酶A[12]。有研究者发现,在前列腺癌中,ACAT1的表达量较正常前列腺细胞增加,且ACAT1的上调与前列腺癌的低分化、高侵袭性以及较差的预后相关[13,14]。在乳腺癌中,ACAT1可通过促进细胞增殖、转移来促进肿瘤发展[15]。在子宫癌的阿霉素治疗过程中,ACAT1可通过增加细胞增殖能力、减少细胞凋亡,促进细胞形成对阿霉素耐药性[16]。ACAT1促进了还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸和脂肪的生成,促进了结直肠癌的发生[8]。以上研究结果提示,ACAT1可能作为促癌基因,在肿瘤发生、发展中发挥作用。
本研究通过对TCGA数据库中371例肝癌患者的测序结果进行分析发现,在肝癌组织中,ACAT1的mRNA表达水平明显低于正常肝组织,并且在对76例肝癌患者PCR分析与4例患者的蛋白免疫印迹分析中,我们验证了ACAT1在肝癌中的这种差异表达。TCGA分析还显示,随着肝癌患者肿瘤的临床分期（StageⅠ ~ Ⅲ期）及病理分级（G1 ~ G4级）的升高,ACAT1的转录水平不断下降。由于Stage Ⅳ期的样本量较小（n < 10）,与Stage Ⅰ期相比,ACAT1的表达量差异不具有统计学意义。我们还发现,ACAT1对诊断肝癌和非肝癌患者预后有良好的提示作用,在ACAT1表达量低的肝癌患者中,其总生存率远低于ACAT1表达量高的肝癌患者,且ACAT1表达量低是肝癌患者低生存率的一个独立危险因素。综上所述,我们推测ACAT1可能作为一个抑癌基因在肝癌的发生、发展中起作用。与我们的研究结果相似的是有学者发现,在肾透明细胞癌中,ACAT1在癌组织中的表达较癌旁正常组织明显减少且与不良预后相关[9, 17]。