糖尿病肾病（DN）是糖尿病全身性微血管病变常见的并发症,是我国终末期肾病（ESRD）的主要病因,并且成为目前慢性疾病防治的重要问题之一[1,2]。越来越多的研究显示,在DN早期,当系膜细胞和内皮细胞尚未改变时就已出现足细胞损伤,表现为足细胞数量减少,胞体缩小,足突增宽融合、消失,进而引起蛋白尿导致肾功能恶化进展[3,4]。因此,足细胞损伤是DN早期重要的病理基础,然而其参与DN发生发展的机制尚未完全阐明。
随着测序技术的发展及精准医学的提出,以 Illumina高通量测序为代表的二代测序技术成为当下检测已知、预测未知RNA的首选技术,为在分子水平寻找生物标志物提供了极大的便利。长链非编码 RNA（lncRNA）是一类数量庞大、转录本长度大于 200个核苷酸且不具有编码蛋白质功能的RNA。近年多项研究显示,lncRNA的异常表达与恶性肿瘤、心血管疾病、神经疾病及代谢性疾病等多种疾病相关[5,6,7]。同时也有研究提示lncRNA 广泛参与DN发生发展的各个环节[6, 8-9]。然而,目前发现功能的lncRNA还是少数,lncRNA的具体作用方式仍未完全清楚。本研究通过对人临床样本肾组织进行RNA-seq测序,检测并分析DN组与正常对照组（NC组）差异表达的lncRNA及其特点,这将有助于深入探讨lncRNA在DN中发挥的作用机制,为寻找DN防治的有效新靶点提供依据。
材料与方法
一、标本来源
本研究收集了2018年10月至2019年12月在广州市第一人民医院住院并经活组织检查（活检）证实为DN的患者肾组织样本4例（DN组）,以及来源于肿瘤相邻的正常肾切除样本肾组织4例（NC组）。DN诊断符合中国防治指南2019年版的诊断标准[10]。DN组标本来源患者中,男2例、女2例,年龄（55.7±3.6）岁,BMI（24.2±2.2）kg/m2;NC组标本来源患者中男2例、女2例,年龄（54.8±4.5）岁,BMI（24.2±2.2）kg/m2。本研究经广州市第一人民医院伦理委员会批准,并获得所有入组患者的知情同意。标本采集后,立即使用RNA保护液浸泡于冻存管中,放入液氮罐中保存备用。
二、主要仪器及试剂
包括Thermo Eppendorf常温/低温离心机,Thermo Nanodrop 2000分光光度计,Roche普通PCR仪,Roche实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪,TRIzol RNA提取液及Takara含EB的RNA载样缓冲液,OMEGA RNA保护液,诺唯赞高效模板DNA（cDNA）一链合成试剂盒,诺唯赞SYBR® Premix Ex TaqTM （GreenⅠ嵌合荧光法法）,Sigma焦碳酸二乙酯（DEPC）。
三、方 法
1.组织RNA的提取
使用TRIzol 提取液提取组织标本RNA,按试剂盒说明步骤操作,提取RNA后使用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA的浓度及鉴定纯度。随后,使用琼脂凝胶电泳鉴定RNA完整度。
2.RNA-seq测序及筛选差异基因
分离提纯RNA后,送上海康成生物工程有限公司行RNA-seq测序,得到肾组织组间差异表达的lncRNA、mRNA及各自表达丰度值（FPKM）等信息。本研究中差异基因筛选标准为：log2 倍数变化（FC）≥ 1 且P≤0.05。log2 FC ≥ 1 即为上调的差异基因,log 2 FC ≤-1 为下调的差异表达基因。
3.基因表达水平检测
将RNA按照试剂盒说明书步骤合成cDNA, 然后进行qRT-PCR,反应体系总体积20 μl,具体如下：SYBR ® Green预混液10 μl、正向引物 0.2 μl、反向引物0.2 μl,无酶水 7.6 μl、cDNA 2 μl。反应条件如下： 94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,58℃ 30 s 共40个循环,72 ℃ 20 s。溶解曲线分析：62 ~ 95 ℃。每份样本重复3次。2 -ΔΔCt法计算荧光强度阈值（Ct值）,以GAPDH为内参,计算样品基因相对表达量。
4.生物信息学分析
选出DN和NC组织之间差异表达的lncRNA和mRNA,并使用R软件（3.4.1版）“limma”软件包将其可视化。简而言之,根据筛选标准Padjust（P < 0.05和FC > 2）处理数据以选择差异表达基因（DEG）。此外,分别采用GO、KEGG数据库进行功能和信号通路富集分析。使用R软件“ggplot2”“easygplot2”软件包,通过dotplot和joyplot将KEGG结果中最丰富的信号通路（调整后的P < 0.01）可视化。Cytoscape（版本3.6.0）用于基于差异表达的lncRNA和mRNA进行共表达网络分析。
四、统计学处理
采用SPSS 22.0进行统计学分析,DN组与NC组肾组织组间差异采用独立样本t检验。差异表达的lncRNA与mRNA之间关系采用Spearman秩相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、lncRNA CRNDE在人DN肾组织中表达上调
DN组与NC组间鉴定出353条差异表达的lncRNA,与NC组相比,DN组中有224条表达上调,129条表达下调。其中以 |log2FC| ≥2且P≤ 0.01为筛选条件,选取了DN组中显著差异表达的上调和下调各20条lncRNA,见 图1A。同时,图1B的火山图显示了DN组与NC组间总的差异表达的lncRNA。进一步,采用qRT-PCR对样本进行验证,与测序结果一致,PVT1（t = -12.518,P < 0.001）、CRNDE（t = -13.964,P < 0.001）和BLZF2P（t = -12.817,P < 0.001）的表达水平在DN组中相对NC组上升,而ST13P6（t = 11.409,P < 0.001）、TARID（t = 9.987,P < 0.001）和WT1-AS（t = 7.787,P < 0.001）在DN组中的表达水平相对NC组下降,见 图1C。
二、足细胞结构与功能决定性基因NPHS1在DN肾组织中表达下调
三、DN组织中lncRNA CRNDE 与NPHS1的表达呈负相关
利用R软件和Cytoscape在DN肾组织差异表达的lncRNA和mRNA之间建立共表达网络,DN组织中lncRNA CRNDE与NPHS1的表达相关,见图3。同时,通过qRT-PCR分析DN临床肾组织样本,Spearman秩相关分析验证了lncRNA CRNDE与NPHS1之间负性相关的表达调控关系（rs = -0.798,P < 0.001）。结果提示lncRNA CRNDE 可能通过调控 NPHS1的表达促进DN足细胞损伤,从而参与调控DN发生发展的过程。
讨论
本研究通过RNA-seq测序挖掘DN中差异表达的lncRNA,DN组与NC组间共检测到353条差异表达的lncRNA,其中224条在DN表达上调,129条表达下调。运用生物信息学分析及qRT-PCR 检测,结果显示在DN组中lncRNA CRNDE表达升高,而其与参与调控足细胞的正常结构和功能的关键基因NPHS1有关。既往研究表明,核因子-κB （NF-κB）是DN的关键炎症刺激通路,同时趋化因子和细胞因子也与炎症状态有关[11]。
NPHS1基因编码的nephrin蛋白,Tossidou 等在2010年已经证明其位于肾小球相邻足细胞之间的裂隙隔膜上,是肾小球足细胞的标志性分子之一。同年,Vitureira 等报道,该蛋白在控制细胞骨架结构、影响足细胞的形态和活性以及维持肾小球滤过功能的完整性等方面发挥着重要作用。适当水平的nephrin表达对正常肾小球功能是必要的。早在2002年Cooper等已经发现在蛋白尿性肾病的动物模型中,nephrin的表达被证明是减少的,尽管还有其他蛋白质参与足细胞的结构,特别是裂孔的结构,但nephrin似乎在阻止蛋白质通过肾小球屏障方面起着关键作用,而DN与大量蛋白尿和裂孔密度降低有关[3, 12-14]。本研究通过RNA-seq筛选及qRT-PCR验证,结果均表明DN肾组织中NPHS1表达下调,明确了DN肾脏存在足细胞损伤,揭示NPHS1的表达调控将有利于阐明足细胞损伤的机制。
lncRNA CRNDE与脓毒症相关肾损伤,炎症通路异常激活触发的疾病,以及与癌症进展相关性,并在其中可能所起的作用已经有了相关报道[15,16,17]。在肾损伤模型中,通过敲低lncRNA CRNDE可以阻断Toll样受体3/NF-κB途径的激活来降低脂多糖诱导的肾损伤[15]。在肺炎模型中,有研究表明CRNDE过表达加重人胚肺细胞（WI-38）的损伤,降低细胞活力,升高细胞凋亡和炎性细胞因子水平[16]。同时有研究表明,lncRNA CRNDE可能通过Toll样受体途径触发炎症反应来调节肿瘤的发生发展[17]。此前的诸多研究表明,炎症状态与DN的发生发展密切相关[18,19]。在结直肠癌中,lncRNA CRNDE通过miR-181a-5p介导的Wnt/β-catenin信号通路传导调控促进癌细胞的增殖和化学抗性[20]。β-catenin是介导DN Wnt信号通路的关键因子,其异常可导致足细胞功能障碍、蛋白尿以及肾脏纤维化[21]。本研究显示lncRNA CRNDE 与NPHS1存在负相关,基于nephrin对于维持足细胞正常结构和发挥功能的重要性,我们推测在DN肾组织中长链非编码RNA CRNDE通过调控NPHS1的表达,从而对足细胞造成损伤,进而破坏肾小球滤过功能的完整性,参与调控了DN的发生发展。
本研究显示,DN中lncRNA CRNDE的表达与NPHS1呈负相关,提示lncRNA CRNDE可能通过调控NPHS1影响足细胞关键蛋白nephrin的表达,从而破坏肾小球滤过屏障的完整性,参与了DN的发生发展。这进一步丰富了DN的发病机制,为DN靶基因治疗提供了新的靶点,为寻找DN诊断及预后的生物学标志物提供依据。而lncRNA CRNDE如何调控NPHS1的表达值得进一步深入研究,这将为阐明DN足细胞损伤提供科学依据。