结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,我国结直肠癌发病率、病死率在全部恶性肿瘤中分别位居第3及第5位[1]。随着分子生物学的发展,结直肠癌的诊治逐渐要求个体化精准治疗;在结直肠癌的诊治当中,错配修复（MMR）蛋白的状态至关重要。研究认为10% ~ 20%的结直肠癌的发病基础为微卫星不稳定（MSI）,即由MMR缺陷造成,MMR蛋白状态也直接影响结直肠癌的预后。美国国立综合癌症网络指南和中国临床肿瘤学会指南均建议结肠癌患者行免疫组织化学检测MMR基因相关蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表达,如果任何1个蛋白表达缺失为错配修复功能缺陷（dMMR）,dMMR相当于高度微卫星不稳定（MSI-H）;所有4种蛋白表达均阳性为错配修复功能完整（pMMR）,pMMR相当于低度微卫星稳定或微卫星稳定。
对象与方法
一、研究对象
采用回顾性分析,收集广州市第一人民医院（华南理工大学附属第二医院）2014至2018年行根治性手术后病理诊断为dMMR结直肠癌患者共106例。纳入标准：①诊断为原发性结直肠癌患者;②行根治性手术患者;③术后病理诊断MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）任何1个蛋白或多个蛋白表达缺失。排除标准：①同时或既往合并其他恶性肿瘤患者;②术前诊断有远处或腹膜转移患者;③术后病理诊断有腹膜转移患者;④合并同时性结直肠多发癌;⑤随访或收集数据不完整的患者。
二、病理诊断标准
常规免疫组织化学方法检测MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2均定位于细胞核,由有经验的2名病理科医师判定阴性或阳性,将4种MMR蛋白中的1种或多种表达缺失（阴性）判定为dMMR。病理分期：患者采用美国癌症联合委员会AJCC分期（第七版）/国际抗癌联盟（UICC）TNM分期进行术后分期。
三、观察指标
收集患者年龄、性别、基础疾病（高血压病史、糖尿病病史、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史）、糖类抗原199（CA199）水平、癌胚抗原（CEA）水平、肿瘤位置、手术方式（腹腔镜和开放）、合并器官切除、术后并发症、肿瘤大小、病理类型、分化程度、T分期、N分期、TNM分期、神经侵犯、脉管侵犯、术后淋巴结获取数量和是否行辅助化疗等指标。
四、随访
采用门诊复查和电话随访相结合的方式进行随访。手术后复查5年,前2年内每3个月随访1次,后3年每年随访1次。随访内容包括：体格检查（包括直肠指诊）、血CEA和CA199、胸部X线、腹部彩色多普勒超声（彩超）及肠镜、胸腹部CT、盆腔MRI等检查。复查结果异常时进一步腹部MRI或骨的放射性核素CT检查,必要时行PET/CT检查[5]。随访终点为发现患者死亡,随访至2021年2月,中位随访时间为54个月。
五、统计学处理
应用SPSS 26.0进行分析。正态分布的计量资料用$\overline{x}±s$表示,无病生存期（DFS）和总生存期（OS）的生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制,生存曲线的比较采用log-rank检验。预后因素分析使用Cox单因素分析,当P值 < 0.05时纳入多因素Cox分析（Forward： LR法）,结果以风险比（HR）值、95%CI、 P值表示。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、dMMR结直肠癌的基线资料
我们收集了106例病理诊断为dMMR的结直肠癌患者,患者术前未发现转移灶,术中没有发现腹膜转移,术后根据指南建议行化疗,部分患者未行化疗。106例患者中男60例、女46例;年龄（60.73±15.69）岁,≥65岁46例, < 65岁60例;术前CEA≥5 ng/ml 39例;术前CA199≥34 U/ml 25例;合并基础疾病（高血压病史、糖尿病病史、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史）24例;升结肠癌48例,横结肠癌14例,降结肠癌及乙状结肠癌22例,直肠癌22例;行腹腔镜手术68例,行开放手术38例;联合器官切除5例,分别为联合切除胆囊、膀胱,小肠和胰腺、十二指肠、子宫各1例;术后出现并发症12例,其中伤口愈合不良4例,肠梗阻3例,肠瘘1例,直肠阴道瘘1例,术后出血1例,肺炎1例,晕厥1例;肿瘤大小≥5 cm 49例, < 5 cm 57例;T1分期2例,T2分期13例,T3分期51例,T4分期40例;N0分期76例,N1分期26例,N2分期4例;TNMⅠ期14例,Ⅱ期62例,Ⅲ期30例;15例患者有脉管侵犯;17例患者有神经侵犯;术后淋巴结获取数量≥12枚76例, < 12枚30例;黏液腺癌患者6例,含黏液成分的癌16例,腺癌84例;低分化腺癌10例,中分化腺癌76例,高分化腺癌4例,未定分化的癌16例（包括黏液腺癌）;行化疗患者56例,未行化疗50例。106例患者MMR蛋白表达情况,MLH1/PMS2缺失率为45%,MSH2/MSH6缺失率为18%,单个MLH1蛋白的缺失率为11％,单个MSH6蛋白的缺失率为9％,单个PMS2蛋白的缺失率为12％,见图1。
二、dMMR结直肠癌的预后影响因素
单因素Cox分析显示术前CEA≥5 ng/ml、直肠、T4、N1、N2、神经侵犯、脉管侵犯和术后淋巴结获取数量< 12枚是dMMR结直肠癌患者DFS的危险因素;多因素Cox分析显示术前CEA≥5 ng/ml、N1、N2和术后淋巴结获取数量< 12枚是dMMR结直肠癌患者DFS的独立危险因素,见表1。
表1 dMMR结直肠癌DFS和OS单因素和多因素Cox分析 |
| 变 量 | DFS | OS | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 单因素分析 | 多因素分析 | 单因素分析 | 多因素分析 | |||||
| HR（95%CI） | P值 | HR（95%CI） | P 值 | HR（95%CI） | P值 | HR（95%CI） | P 值 | |
| 年龄（> 65岁） | 1.03（0.43 ~ 2.43） | 0.955 | 2.02（0.77 ~ 5.31） | 0.154 | ||||
| 性别 | 1.90（0.80 ~ 4.50） | 0.147 | 1.22（0.47 ~ 3.16） | 0.683 | ||||
| 基础疾病 | 0.55（0.16 ~ 1.87） | 0.340 | 0.69（0.20 ~ 2.39） | 0.555 | ||||
| CEA ≥5 ng/ml | 2.57（1.08 ~ 6.11） | 0.032 | 2.68（1.08 ~ 6.63） | 0.034 | 2.71（1.03 ~ 7.12） | 0.043 | ||
| CA199 ≥34 U/ml | 1.92（0.78 ~ 4.77） | 0.159 | 3.08（1.16 ~ 8.15） | 0.024 | ||||
| 肿瘤位置（直肠vs.结肠） | 3.10（1.31 ~ 7.36） | 0.010 | 2.71（1.03 ~ 7.12） | 0.044 | ||||
| 手术方式（腹腔镜vs.开放） | 0.71（0.30 ~ 1.68） | 0.429 | 0.75（0.29 ~ 1.98） | 0.565 | ||||
| 联合器官切除 | 0.97（0.13 ~ 7.23） | 0.976 | 1.11（0.15 ~ 8.42） | 0.917 | ||||
| 术后并发症 | 2.08（0.70 ~ 6.17） | 0.189 | 2.72（0.89 ~ 8.34） | 0.081 | ||||
| 肿瘤大小≥5 cm | 0.72（0.30 ~ 1.73） | 0.460 | 0.87（0.33 ~ 2.28） | 0.770 | ||||
| 病理类型（腺癌vs.含黏液癌） | 1.18（0.43 ~ 3.23） | 0.743 | 1.21（0.39 ~ 3.71） | 0.743 | ||||
| 分化类型（低分化vs.其他） | 1.85（0.54 ~ 6.28） | 0.325 | 2.54（0.73 ~ 8.90） | 0.145 | ||||
| MLH1缺失 | 2.47（0.91 ~ 6.73） | 0.079 | 0.40（0.13 ~ 1.23） | 0.109 | ||||
| MSH2缺失 | 0.62（0.18 ~ 2.12） | 0.448 | 2.10（0.48 ~ 9.20） | 0.324 | ||||
| MSH6缺失 | 0.50（0.17 ~ 1.48） | 0.209 | 2.25（0.65 ~ 7.85） | 0.202 | ||||
| PMS2缺失 | 0.83（0.35 ~ 1.98） | 0.681 | 1.00（0.38 ~ 2.63） | 0.998 | ||||
| （T1 ~ T3）vs.T4 | 3.10（1.28 ~ 7.49） | 0.012 | 3.43（1.27 ~ 9.28） | 0.015 | ||||
| N分期 | 0.002 | 0.002 | 0.008 | |||||
| N0 | 参照组 | 参照组 | ||||||
| N1 | 2.79（1.10 ~ 7.07） | 0.031 | 2.94（1.12 ~ 7.73） | 0.028 | 4.06（1.47 ~ 11.21） | 0.007 | 6.64（2.25 ~ 19.64） | 0.001 |
| N2 | 9.61（2.58 ~ 35.88） | 0.001 | 9.31（2.49 ~ 34.77） | 0.001 | 6.55（1.36 ~ 31.62） | 0.019 | 9.68（1.92 ~ 48.96） | 0.006 |
| 神经侵犯 | 3.18（1.28 ~ 7.89） | 0.013 | 1.91（0.62 ~ 5.87） | 0.257 | ||||
| 脉管侵犯 | 2.70（1.05 ~ 6.96） | 0.040 | 1.40（0.40 ~ 4.86） | 0.601 | ||||
| 术后淋巴结获取数量（< 12枚） | 3.15（1.34 ~ 7.41） | 0.009 | 3.97（1.66 ~ 9.5） | 0.002 | 3.97（1.51 ~ 10.45） | 0.005 | 6.36（2.28 ~ 17.73） | <0.001 |
| 有辅助化疗 | 0.97（0.41 ~ 2.27） | 0.934 | 0.76（0.29 ~ 1.97） | 0.573 | ||||
单因素Cox分析显示术前CEA≥5 ng/ml、术前CA199≥34 U/ml、直肠、T4、N1、N2、和术后淋巴结获取数量< 12枚是dMMR结直肠癌患者OS的危险因素;多因素Cox分析显示N1、N2和术后淋巴结获取数量< 12枚是dMMR结直肠癌患者OS的独立危险因素,见表1。
三、辅助化疗对Ⅱ、Ⅲ期dMMR结直肠癌的影响
Ⅱ期dMMR结直肠癌化疗组与无化疗组DFS比较无统计学差异（log-rank检验x2值 = 0.543,P = 0.461）;Ⅱ期dMMR结直肠癌化疗组与无化疗组OS比较差异无统计学意义（log-rank检验x2 = 0.756,P = 0.385）。Ⅲ期dMMR结直肠癌化疗组与无化疗组DFS比较差异无统计学意义（log-rank检验x2值 = 1.125,P = 0.298）;Ⅲ期dMMR结直肠癌化疗组与无化疗组OS比较差异无统计学意义（log-rank检验x2值 = 0.803,P = 0.370）,见图2。
讨论
MMR是细胞DNA在复制过程中选择性移除整合了错误核苷酸的新生DNA,防止子代细胞出现基因突变的过程。MMR的产物是MMR蛋白,包括MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1 和PMS2等。结直肠癌的MMR蛋白检测主要为MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2,通常使用免疫组化检测任何一个或多个蛋白缺失（阴性）则诊断为dMMR。错配修复蛋白家族具有一些基本特征,由两个错配修复功能的复合体构成;MLH1和PMS2是一个复合体,MSH2和MSH6是一个复合体,其中MLH1和MSH2是两个复合体内的主要功能蛋白。大部分散发性dMMR结直肠癌（约80％）是由MLH1基因启动子的甲基化引起的,而超过70％的遗传病例与MLH1和MSH2基因的种系突变有关[6]。本研究调查的数据中3例有家族性遗传倾向。我们的数据也显示MLH1/PMS2缺失率为45%,MSH2/MSH6缺失率为18%,单个MLH1蛋白的缺失率为11％,单个MSH6蛋白的缺失率为9％,单个PMS2蛋白的缺失率为12％,这与既往的研究类似[7]。同时,我们发现4种MMR蛋白的状态都不是dMMR结直肠癌的预后影响因素。
研究认为大约有10% ~ 20%的结直肠癌的发病基础为MSI / dMMR,dMMR结直肠癌的预后比pMMR结直肠癌更好[2-3, 8]。本研究显示dMMR结直肠癌更好发于右半结肠,直肠癌是预后不良的一个危险因素。淋巴结转移N1、N2是dMMR结直肠癌患者DFS和OS的独立危险因素,表明Ⅲ期dMMR结直肠癌预后较Ⅰ和Ⅱ期更差。NCCN指南规定Ⅱ期结直肠癌术后淋巴结获取数量< 12枚为高危因素,我们的研究也显示术后淋巴结获取数量< 12枚是dMMR结直肠癌患者DFS和OS的独立危险因素。我们还发现术前CEA≥5 ng/ml是dMMR结直肠癌患者DFS的独立危险因素,在dMMR结直肠癌术前CEA≥5 ng/ml提示预后较差,我们查阅相关文献未找到类似的报道。我们的研究提示在dMMR结直肠癌患者治疗过程中,如果患者有这些危险因素可以考虑密切复查,或调整辅助治疗方案,比如联合使用靶向或免疫治疗。
结直肠癌指南推荐Ⅲ期和高危Ⅱ期的结直肠癌行术后辅助化疗,然而鉴于dMMR结直肠癌对化疗敏感性较差（主要为氟尿嘧啶类）,所以辅助化疗对dMMR 结直肠癌的作用存在争议,尤其是Ⅱ期患者的辅助化疗争议较大[9]。对于高危Ⅱ期MSI-H/dMMR结直肠癌患者,目前NCCN指南建议患者单纯观察,而中国临床肿瘤学会指南则建议此类患者行联合化疗[10]。对于Ⅲ期dMMR结直肠癌,尽管指南推荐辅助化疗,但研究显示辅助化疗对Ⅲ期dMMR结直肠癌的作用仍然存在争议。目前大部分研究支持氟尿嘧啶单药对Ⅲ期dMMR结直肠癌辅助治疗不获益;而奥沙利铂在dMMR情况下并不影响其与DNA形成螯合物来发挥抗肿瘤作用,同时有研究关注Ⅲ期dMMR 结直肠癌可能需要将靶向治疗和免疫治疗作为一线治疗[11,12,13,14]。本研究的辅助化疗方案都为氟尿嘧啶为基础的化疗,为卡培他滨单药、XELOX或mFOLFOX方案,因此本研究结果显示Ⅱ期、Ⅲ期dMMR结直肠癌的化疗组与无化疗组DFS、OS差异无统计学意义,显示化疗并未影响其预后。遗憾的是因为病例数量有限,深入分层研究比较困难,需要以后进一步的深入研究。
我们的研究也存在以下不足,本研究为回顾性研究,可能存在偏倚;同时因为我们收集的病例只用免疫组化检测MMR蛋白,未使用PCR检测MSI状态,可能会纳入极少部分不是MSI-H表型的患者（大部分研究显示5%以下）。
综上所述,术前CEA≥5 ng/ml是dMMR结直肠癌患者DFS的独立危险因素;N1、N2和术后淋巴结获取数量< 12枚是dMMR结直肠癌患者DFS和OS的独立危险因素。辅助化疗不影响Ⅱ、Ⅲ期dMMR结直肠癌的预后。