慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是耳鼻喉科常见疾病之一,为鼻黏膜持续性的、过度的慢性黏膜炎症反应,常见于老年人、哮喘患者,发病率男性高于女性,患者形成鼻息肉,临床症状表现为鼻塞、脓涕、张口呼吸等。患者嗅觉减退,当中鼻甲严重压迫鼻中隔时会引发筛前神经综合征,严重影响患者的日常生活[1]。临床治疗CRSwNP手段众多,包括药物、按摩、热疗及手术切除,但患者即便是得到规范性的药物、手术治疗,其复发率仍处于较高水平,因此学者们也在积极探索CRSwNP发生发展的分子机制以期为临床治疗提供新的途径[2,3]。
在研究CRSwNP发生、发展机制的过程中,学者们越来越多地关注到微RNA（miR）所扮演的角色。miR是一类非编码的小分子RNA,可通过调控下游靶基因的表达,影响细胞的增殖、分化、凋亡等过程,在鼻咽癌、变应性鼻炎、慢性鼻-鼻窦炎等疾病中均发挥着重要的作用[4]。miR-21是miRNA家族中的一个重要成员,位于人染色体17q23.2上,具有高度的保守性。研究表明miR-21广泛参与调节机体的炎症免疫反应,在多种炎性反应中表达水平均有明显升高的现象[5,6]。近期Li等[7]在研究中发现miR-21在CRSwNP组织中表达明显升高,并且与鼻黏膜上皮细胞的炎症反应有关,但是作用机制尚不明确。因此,本研究选取人鼻黏膜上皮细胞（HNEpC）作为研究对象,观察miR-21对脂多糖诱导的HNEpC增殖、凋亡及炎症因子水平的影响,并进一步探讨其可能的作用机制。
材料与方法
一、材料与试剂
HNEpC购自上海沪震公司;脂多糖购自美国sigma公司;miR-21抑制物miR-21 inhibitor、阴性对照物inhibitor-NC及所有引物购自上海吉玛公司;TRIzol试剂、LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司;CCK-8试剂盒购自上海雅吉生物公司;凋亡检测试剂盒购自上海群己生物公司;TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的ELISA试剂盒均购自南京建成生物公司;一抗磷酸酶及张力蛋白同源物 （PTEN）、GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司;二抗购自北京中杉金桥公司。
二、方法
1.细胞培养及转染
HNEpC按照说明书在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,置入37℃、5% CO2条件下的细胞培养箱中培养,待细胞融合度达70%左右时,胰酶消化、传代。应用脂多糖诱导HNEpC细胞时,按照终浓度1 mg/L脂多糖刺激细胞时间的不同分为0 h组、12 h组、24 h组、48 h组。转染操作时,取生长状态良好的对数生长期的HNEpC细胞接种到6孔细胞板,细胞分为miR-21抑制物组和阴性对照组,应用LipofectamineTM2000转染试剂盒参照说明书进行操作,分别将miR-21 inhibitor和inhibitor-NC转染至HNEpC细胞,转染后24 h再用脂多糖（1 mg/L）刺激细胞24 h后进行后续实验。
2.荧光定量-PCR（qRT-PCR）
应用TRIzol试剂提取HNEpC细胞总RNA,应用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。以cDNA为模板,应用qRT-PCR试剂盒配置反应体系进行PCR反应。反应条件为：95℃5 min;95℃20 s,60℃45 s,共进行45个循环。miR-21引物：上游5’-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3’,下游5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’;内参基因U6引物：上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游5’-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-21相对表达水平应用2-△△Ct法进行计算。
3. CCK-8实验
取各组脂多糖刺激24 h后的HNEpC细胞,于检测前1 h 加入10 μl CCK-8溶液,将细胞培养板置于培养箱中继续孵育4 h,用酶标仪测得各组HNEpC细胞不同时点在450 nm波长处的吸光度值（OD450）。
4.流式细胞术
取各组脂多糖刺激24 h后的HNEpC细胞,胰蛋白酶消化后用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次,Bingding Buffer液重悬细胞,分别依次加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 5μl,充分混匀后于室温下避光反应15 min,立即采用流式细胞仪检测各组HNEpC细胞的凋亡率。
5. ELISA
取各组脂多糖刺激24 h后HNEpC细胞,收集细胞上清液,应用ELISA试剂盒检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等炎性因子的水平。
6.蛋白免疫印迹法
收集HNEpC细胞,PBS洗涤细胞后,裂解提取细胞总蛋白,BCA法行蛋白定量制备样品。各组细胞取等量蛋白上样行SDS-PAGE、半干转法转膜,应用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,细胞洗涤后,分别加入一抗PTEN（稀释度1∶1000）和GAPDH（稀释度1∶2000）抗体,4℃孵育过夜,洗膜后加入二抗,室温孵育1 ~ 2 h,ECL显影、定影。
三、统计学处理
采用SPSS 22.0处理数据,实验均重复3次,正态分布计量资料以$\overline{x}±s$表示,2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用Dunnet-t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、脂多糖诱导前、后HNEpC细胞中miR-21和PTEN蛋白的表达变化
二、抑制miR-21对HNEpC细胞增殖活性的影响
三、抑制miR-21对HNEpC细胞凋亡的影响
流式细胞术结果显示,miR-21抑制物组细胞凋亡率为（27.5±4.9）%,高于阴性对照组的（13.0±3.4）%,2组比较差异有统计学意义（t = 4.211,P = 0.014）,见图3。
四、抑制miR-21对HNEpC细胞炎性因子水平的影响
ELISA检测结果显示,miR-21抑制物组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于阴性对照组（P均 < 0.05）,而IL-10水平高于阴性对照组（P < 0.05）,见表1。
表1 2组细胞炎性因子水平的比较（$\overline{x}±s$） 单位：pg/ml |
| 组 别 | TNF-α | IL-1β | IL-6 | IL-10 |
|---|---|---|---|---|
| 阴性对照组 | 138.27±16.39 | 115.68±13.28 | 99.43±19.33 | 58.31±12.78 |
| miR-21抑制物组 | 76.75±11.42 | 66.20±12.37 | 43.38±10.04 | 105.16±10.78 |
| t值 | 5.334 | 4.722 | 4.457 | 4.854 |
| P值 | 0.006 | 0.009 | 0.011 | 0.008 |
五、抑制miR-21对HNEpC细胞PTEN蛋白表达水平的影响
讨论
CRSwNP发病机制复杂,需要长期规范性的用 药治疗,甚至需要行鼻内镜切除术,然而仍有相当一部分患者严格遵守治疗原则,其仍有较高的复发率[8,9,10]。因此探索CRSwNP炎症反应的分子机制,帮助临床医师寻求新的治疗途径,已成为当前学者的研究重点。随着miR在各疾病中作用的不断探索,近年来其在CRSwNP中的作用机制也是研究热点之一。Li等[11]发现miR-4492在CRSwNP组织中表达下调,可能通过JAK/STAT信号通路参与CRSwNP的发生进展。郑辉等[12]发现抑制miR-107表达能够抑制脂多糖诱导的HNEpC的炎症反应和增殖从而参与CRSwNP的发生进展。miR的发现为临床治疗CRSwNP提供了新的研究方向[4]。
本研究中我们通过观察脂多糖诱导的HNEpC细胞不同时间的miR-21表达水平发现,脂多糖诱导的HNEpC细胞中miR-21表达水平明显增高,提示异常高表达的miR-21可能参与了CRSwNP的发生发展。为了进一步探讨miR-21对脂多糖诱导的HNEpC细胞增殖、凋亡和炎症反应的影响,我们通过脂质体转染法转染miR-21抑制物至HNEpC细胞,研究发现抑制miR-21表达的HNEpC细胞,经脂多糖诱导后24、48、72 h的吸光度值均明显降低,而凋亡率明显升高,并且细胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均明显下降,而IL-10水平明显上升,提示抑制miR-21可显著抑制脂多糖诱导的HNEpC细胞的增殖活性和炎症反应,同时促进其凋亡,从而参与CRSwNP的发生发展。
PTEN是人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因,是目前研究中证实与炎症反应密切相关的基因之一。PTEN基因编码双重底物特异性磷酸酶,具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性,能够抑制PI3K/AKT信号通路从而起到抗炎作用[17]。既往研究者发现PTEN在CRSwNP中表达降低,PTEN能够增强HNEpC对炎症的抵抗力[18,19]。抑制PTEN的表达既能抑制上呼吸道黏膜纤毛细胞的凋亡,又能诱导上皮化生杯状细胞,从而增加黏膜上皮中黏液的分泌,降低排黏液功能[20]。国内外多个研究表明,miR-21可通过调控PTEN基因参与细胞增殖、凋亡并介导多种炎性反应[21,22]。因此我们推测miR-21在CRSwNP中的作用可能与其调控PTEN有关。在本研究中我们通过蛋白免疫印迹法发现,脂多糖诱导的HNEpC细胞中PTEN蛋白的表达水平明显降低。并且我们进一步发现,抑制miR-21表达的HNEpC细胞中PTEN蛋白的表达水平明显升高,提示miR-21能够靶向调控HNEpC细胞中PTEN蛋白的表达,miR-21对脂多糖诱导的HNEpC增殖、凋亡及炎症因子水平的影响可能与其对PTEN基因的调控有关。
综上所述,miR-21在脂多糖诱导的HNEpC炎症反应细胞模型中表达升高,抑制miR-21可显著抑制HNEpC炎症反应细胞的增殖活性和炎症反应,同时促进其凋亡,其机制可能与其对PTEN基因的调控有关,为CRSwNP的治疗提供了新的研究方向。