结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一,其发病率、病死率高且逐年上升,预后较差[1]。肿瘤转移是结直肠癌患者死亡的主要原因,因而探究结直肠癌的发生发展机制,为结直肠癌靶向治疗提供科学基础,对于提高结直肠癌的治愈率至关重要。然而,目前仍未完全清楚结直肠癌肿瘤进展的具体机制。据相关研究,已知在这一过程中涉及到多基因的异常表达,如PIK3CA的基因突变、癌基因Ras的激活、抑癌基因p53的失活等,这些都是编码蛋白的基因[2,3,4]。此外,尚有不编码蛋白质的RNA,称为非编码RNA（ncRNA）,在结直肠癌进展过程中起重要的调控作用[2]。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类位于胞浆或细胞核部分、长度大于200个核苷酸的RNA,lncRNA基本不参与编码蛋白,也属于ncRNA,可通过参与遗传、转录和转录后调控等多个层面调节疾病的发生、发展[5]。相关研究表明,lncRNA广泛参与生理和病理各个过程,特别在癌症中具有重要的调节作用[6]。癌基因SEI1（又名SERTAD1或TRIP-Br1）是一个位于19q13.1至19q13.2的细胞周期调控基因,在许多癌症中该基因均有异常表达。SEI1基因产物p34SEI1是Sertad家族的一部分,它是一种周期蛋白依赖激酶4（CDK4）结合蛋白,通过促进CDK4-CCND复合物的缔合和刺激CDK4的活性来对抗p16对细胞周期进程的抑制活性[7,8]。相关研究显示SERTAD1的过表达与头颈癌有关[9]。此外,SERTAD1差异表达还与多种癌症类型相关,例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、白血病和淋巴瘤[10]。通过生物信息学分析序列对比,查找SERTAD1,发现该编码基因附近存在lncRNA,即lnc-SERTAD1-1,其染色体位置非常靠近SERTAD1,作为上游因子的一个反式作用因子与顺式作用元件结合,参与基因表达的调控。目前,关于lnc-SERTAD1-1在结直肠癌中的功能和作用机制报道较少。本研究组旨在分析lnc-SERTAD1-1在结直肠癌中的表达水平及对预后的影响,探究lnc-SERTAD1-1对结直肠癌增殖及转移的影响,以期为结直肠癌治疗提供新的靶标。
材料与方法
一、材料
1.标本
收集2009年3月至2012年2月广州医科大学附属第二医院胃肠外科的125例结直肠癌患者的标本（手术切除）,标本为配对的癌组织和癌旁正常组织（距癌组织≥5 cm的边缘）。本组结直肠癌患者的入选标准：①接受切除术且术后病理活组织检查（活检）明确诊断为结直肠癌;②术前均未进行放射治疗、化学治疗或其他抗癌治疗;③术后随访结果完整,生存、复发和转移等情况明确。排除标准：①非原发性结直肠癌者;②家族性息肉病恶变者。所有结直肠癌患者的肠癌及癌旁正常组织标本采集以RNA保护液处理并以液氮保存。术后随访以首次诊断之日为起点,总生存以术后死亡为随访终点。术后出现复发转移作为无病生存的随访终点。术后第1年每3个月随访1次,之后每6个月门诊随访1次。随访方式以电话、微信和门诊复查相结合。随访截止时间为2018年2月,随访时间中位数为83个月,所有患者均签署知情同意书,且本研究经广州医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准。
2. 细胞株
人结直肠癌细胞HCT15及人源胚胎细胞293T均由广州医科大学分子流行病学实验室吕嘉春教授惠赠。正常人结肠组织细胞CCD-18Co购自杭州美森细胞生物有限公司。HCT15用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养,CCD-18Co、293T用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养,置于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱内,当细胞生长的融合度为70％ ~ 80％时,取生长状态好的细胞用于实验。
二、试剂与仪器
BiooPureTM RNA Isolation Reagent购自Bioo Scientific,DEPC处理水购自北京莱索宝科技有限公司,PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser购自Takara,TE缓冲液购自北京莱索宝科技有限公司,SYBR Green实时定量PCR试剂盒购自DBI Bioscience;lnc-SERTAD1-1引物委托广州复能基因有限公司合成,7900T荧光定量PCR仪购自cABI,-80℃超低温冰箱购自Thermo Scientific,ND-1000自动紫外分光光度计购自Thermo Scientific,SM-F123制冰机购自SANYO;Multiskan全自动酶标仪购自ThermoFisher;低速离心机购自中佳;FRESCO17高速低温离心机购自Thermo。
三、研究方法
1. RNA的提取
采用BiooPureTM RNA Isolation Reagent法提取总RNA,紫外分光光度计测定波长260 ~ 280 nm 处的吸光度,计算OD260/280,鉴定RNA纯度。并随机抽取几对样品的癌组织及癌旁正常组织RNA进行核酸电泳,结果显示RNA的量是相对准确可信的。
2. 实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测lnc-SERTAD1-1的表达
提取总RNA后定量,逆转录为cDNA。lnc-SERT-AD1-1引物,上游5'-TTTGGGACTTTCGGAGCAG-3',下游5'-GACTTCAGGGCAATAGGA-3';β-actin引物,上游5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3',下游5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。qRT-PCR结束后用2-△Ct法处理实验数据,其中,中位数及以上（≥0.000 970）为高表达,中位数以下（< 0.000 970）则为低表达。
3. 细胞稳定转染及慢病毒感染靶细胞构建细胞系
应用GeneCopoeia LentiPac HIV 慢病毒表达系统按实际说明书进行实验操作,将含有目的基因lnc-SERTAD1-1过表达的质粒及含有空白载体质粒分别与转染试剂混合,得到2种试剂混合液,通过转染,制备并收集对应的病毒液。采取稳定转染的方法将2种病毒液分别感染靶细胞HCT15,构建含有目的基因lnc-SERTAD1-1过表达的HCT15（HO）及含有空载体质粒的HCT15（HOC）,最后通过药物筛选去除未稳定转染成功的HCT15,最终得到实验所需的细胞。稳定转染后,得到HOC及HO继续培养细胞并提取细胞RNA,逆转录成cDNA行qRT-PCR验证,实验重复4次,明确HO过表达lnc-SERTAD1-1。
4. 平板克隆形成实验
将稳转成功并经药物筛查的2种细胞HO及HOC以200个/孔接种于6孔板中,每种细胞3个副孔,置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养14 d后,去上清,用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次,4％多聚甲醛溶液固定15 min,0.1％结晶紫溶液染色20 min,染色后对肉眼可见的克隆团进行计数,计算克隆形成率（克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%）,实验重复6次。
5. 细胞迁移实验（Transwell）
将稳定转染成功并经药物筛查的2种细胞HO及HOC消化并适度稀释,用血细胞计数板计数细胞密度。将200 μl（5×104个）细胞悬液接种于小室上层,将600 μl含20％血清的RPMI 1640培养基加至小室下层。置于37℃、 5％二氧化碳细胞培养箱培养24 h,取出小室,用PBS洗2 ~ 3次,用棉签擦除小室膜上层未穿过膜的细胞,用4％多聚甲醛溶液固定20 min,室温干燥小室,0.1％结晶紫染色30 min,用干净棉签再次擦除未穿过小室的小室上层细胞,用流动水冲洗小室上多余的结晶紫,室温干燥小室。使用100倍倒置显微镜,随机选择5个视野拍照,然后计算细胞数,实验重复5次。
6. 蛋白免疫印迹法
将稳转成功并经药物筛查后的2种细胞HO及HOC传代于6孔板中,每种细胞3个复孔,置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养。待细胞生存状态良好,融合度达70% ~ 80%时,分别提取这2种细胞的蛋白,按蛋白免疫印迹法常规操作步骤验证下游蛋白SERTAD1在HOC和HO的表达水平,实验重复4次。
四、统计学处理
运用SPSS 19.0、GraphPad Prism 8.0处理实验结果,并进行统计分析,符合正态分布的定量资料用$\bar{x} \pm s$表示,组间比较采用t检验,方差不齐采用校正t检验;非正态分布的定量资料用M（P25,P75）表示,组间比较采用Mann Whitney U检验。lnc-SERTAD1-1在癌组织与癌旁正常组织中的表达水平比较采用符号秩和检验;lnc-SERTAD1-1表达水平与患者临床病理特征之间的相关性用x2检验。根据lnc-SERTAD1-1的表达水平中位数分为lnc-SERTAD1-1低表达和lnc-SERTAD1-1高表达,< 0.000 970为低表达组,≥0.000 970为高表达组。计算结直肠癌患者总生存期（OS）及无病生存期（DFS）,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,log-rank检验对比生存曲线,分析lnc-SERTAD1-1表达对结直肠癌患者生存率的影响。采用多因素Cox比例风险模型（进入法）评估lnc-SERTAD1-1的表达水平及不同临床病理特征与患者预后的关系,以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、lnc-SERTAD1-1在癌组织与癌旁正常组织中的表达水平
二、lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co与HCT15中的表达
采用qRT-PCR检测lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co与HCT15中的表达水平,结果提示lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co中的表达高于HCT15 （n = 4,t = 4.565,P = 0.004）,见图3。
三、lnc-SERTAD1-1的表达与结直肠癌临床病理特征的关系
125例结直肠癌患者中lnc-SERTAD1-1低表达样本（2-△Ct < 0.000 970）62例（49.6%）。直肠癌患者、肿瘤直径 < 5 cm者及大体分型为肿块型者,其lnc-SERTAD1-1的表达水平越低,见表1。
表1 125例结直肠癌患者临床病理特征与lnc-SERTAD1-1表达的关系[例（%）] |
| 临床病理因素 | 例数 | 低表达样本（62例） | 高表达样本（63例） | x2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 性别 | 2.379 | 0.123 | |||
| 男 | 70 | 39（55.7） | 31（44.3） | ||
| 女 | 55 | 23（41.8） | 32（58.2） | ||
| 年龄 | 1.151 | 0.562 | |||
| < 50岁 | 18 | 8（44.4） | 10（55.6） | ||
| 50 ~ 60岁 | 35 | 20（57.1） | 15（42.9） | ||
| > 60岁 | 72 | 34（47.2） | 38（52.8） | ||
| 肿瘤部位 | 6.350 | 0.042 | |||
| 直肠 | 72 | 42（58.3） | 30（41.7） | ||
| 左半结肠 | 32 | 14（43.8） | 18（56.2） | ||
| 右半结肠 | 21 | 6（28.6） | 15（71.4） | ||
| 肿瘤直径 | 4.419 | 0.036 | |||
| < 5 cm | 73 | 42（57.5） | 31（42.5） | ||
| ≥5 cm | 52 | 20（38.5） | 32（61.5） | ||
| 肿瘤分化程度 | 2.098 | 0.350 | |||
| 高 | 21 | 13（61.9） | 8（38.1） | ||
| 中 | 93 | 45（48.4） | 48（51.6） | ||
| 低 | 11 | 4（36.4） | 7（64.6） | ||
| 肿瘤大体分型 | 8.060 | 0.018 | |||
| 肿块型 | 51 | 33（64.7） | 18（36.3） | ||
| 环窄型 | 12 | 4（33.3） | 8（66.7） | ||
| 溃疡型 | 62 | 25（40.3） | 37（59.7） | ||
| 淋巴结转移 | 2.305 | 0.129 | |||
| 无 | 67 | 29（43.3） | 38（56.7） | ||
| 有 | 58 | 33（56.9） | 25（43.1） | ||
| 肿瘤浸润深度 | 2.237 | 0.135 | |||
| 黏膜+肌层 | 13 | 9（69.2） | 4（30.8） | ||
| 全层 | 112 | 53（47.3） | 59（52.7） |
四、结直肠癌患者不同临床病理特征与生存率的多因素分析
采用Cox比例风险模型进行多因素预后分析,结果显示,肿瘤大体分型为环窄型、TNM分期Ⅲ ~ Ⅳ期是结直肠癌患者术后OS和DFS的独立危险因素;年龄 > 60岁是结直肠癌患者术后OS的独立危险因素,但不是结直肠癌DFS的独立危险因素;lnc-SERTAD1-1高表达则是结直肠癌患者OS及DFS的独立保护因素,见表2。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线,125例结直肠癌患者的1年生存率、3年生存率、5年生存率分别为96.0%、82.4%、67.2%,见图4A。lnc-SERTAD1-1低表达组与高表达组1年生存率分别为93.5%、98.4%,3年生存率为69.4%、95.2%,5年生存率为50.0%、82.5%,log-rank检验提示,lnc-SERTAD1-1低表达组的生存率比lnc-SERTAD1-1高表达组低（P < 0.001）,见图4B。
表2 125例结直肠癌患者OS及DFS的多因素Cox分析 |
| 项 目 | OS | DFS | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| B | HR（95% CI） | P值 | B | HR（95% CI） | P值 | |
| 性别 | ||||||
| 男 | 1.000 | 1.000 | ||||
| 女 | -0.037 | 0.964（0.500 ~ 1.859） | 0.913 | -0.186 | 0.830（0.409 ~ 1.686） | 0.607 |
| 年龄 | 0.047 | 0.900 | ||||
| < 50岁 | 1.000 | 1.000 | ||||
| 50 ~ 60岁 | 1.265 | 3.545（0.968 ~ 12.977） | 0.056 | -0.086 | 0.917（0.290 ~ 2.897） | 0.883 |
| > 60岁 | 1.572 | 4.815（1.376 ~ 16.848） | 0.014 | 0.105 | 1.111（0.367 ~ 3.360） | 0.853 |
| 肿瘤部位 | 0.251 | 0.143 | ||||
| 直肠 | 1.000 | 1.000 | ||||
| 左半结肠 | -0.058 | 0.943（0.425 ~ 2.093） | 0.886 | -0.369 | 0.691（0.263 ~ 1.816） | 0.454 |
| 右半结肠 | -0.973 | 0.378（0.120 ~ 1.193） | 0.097 | -1.111 | 0.329（0.105 ~ 1.028） | 0.056 |
| 肿瘤直径 | ||||||
| < 5 cm | 1.000 | 1.000 | ||||
| ≥5 cm | 0.588 | 1.800（0.883 ~ 3.669） | 0.106 | 0.587 | 1.798（0.797 ~ 4.057） | 0.157 |
| 肿瘤分化程度 | 0.361 | 0.503 | ||||
| 高 | 1.000 | 1.000 | ||||
| 中 | 0.194 | 1.214（0.511 ~ 2.885） | 0.661 | 0.625 | 1.867（0.657 ~ 5.305） | 0.241 |
| 低 | -1.272 | 0.280（0.033 ~ 2.372） | 0.243 | -12.570 | 0.000（0.000 ~ 3.662） | 0.970 |
| 肿瘤大体分型 | 0.032 | 0.006 | ||||
| 肿块型 | 1.000 | 1.000 | ||||
| 环窄型 | 1.620 | 5.054（1.503 ~ 16.989） | 0.009 | 1.958 | 7.088（2.129 ~ 23.601） | 0.001 |
| 溃疡型 | 0.532 | 1.703（0.780 ~ 3.715） | 0.181 | 0.477 | 1.611（0.701 ~ 3.703） | 0.261 |
| TNM分期 | ||||||
| Ⅰ ~ Ⅱ | 1.000 | 1.000 | ||||
| Ⅲ ~ Ⅳ | 1.190 | 3.286（1.644 ~ 6.572） | 0.001 | 0.910 | 2.484（1.207 ~ 5.115） | 0.014 |
| lnc-SERTAD1-1表达 | ||||||
| < 0.000 970 | 1.000 | 1.000 | ||||
| ≥0.000 970 | -1.481 | 0.228（0.107 ~ 0.485） | < 0.001 | -1.478 | 0.228（0.103 ~ 0.506） | < 0.001 |
五、稳定转染后lnc-SERTAD1-1在HOC与HO中的表达
采用qRT-PCR验证稳定转染后的HOC和HO中lnc-SERTAD1-1的表达,结果提示lnc-SERTAD1-1在HO中的表达高于HOC（n = 4,t' = -12.019,P < 0.05）,见图5。
六、lnc-SERTAD1-1对结直肠癌细胞增殖的作用
平板克隆实验检测lnc-SERTAD1-1对结直肠癌细胞克隆形成的影响。在HO中,细胞克隆形成数低于HOC（n = 6,t' = -2.569,P = 0.039）,见图6。结果提示lnc-SERTAD1-1抑制结直肠癌细胞克隆形成。
七、lnc-SERTAD1-1对结直肠癌细胞的迁移作用
使用Transwell小室检测HO体外迁移能力。对lnc-SERTAD1-1过表达后,观察到HO穿过Transwell小室的数量较HOC少（n = 5,t = 7.120,P < 0.001）,见图7。实验结果表明,lnc-SERTAD1-1抑制结直肠癌细胞的体外迁移。
八、蛋白免疫印迹法检测下游蛋白SERTAD1在HOC与HO中的表达
讨论
本研究显示,结直肠癌组织中lnc-SERTAD1-1的表达量较相应的癌旁正常组织低,lnc-SERTAD1-1在肠癌细胞中的表达亦低于正常肠黏膜细胞。这与Xi等[13]研究结果一致,提示lnc-SERTAD1-1与SERTAD1可能存在正相关关系,调控该基因的表达。分析该组病例中lnc-SERTAD1-1与其临床病理特征的关系,发现肿瘤部位、直径及肿瘤的大体分型与结直肠癌中lnc-SERTAD1-1的表达相关,结直肠癌中lnc-SERTAD1-1的低表达以直肠癌、肿瘤直径 < 5 cm、肿瘤大体分型为肿块型者更为多见,并且lnc-SERTAD1-1的高表达是结直肠癌OS的独立保护因素,也是结直肠癌患者术后DFS的独立保护因素。随后的人群预后关联分析提示lnc-SERTAD1-1高表达是结直肠癌患者OS、DFS的独立保护因素,明确了lnc-SERTAD1-1对结直肠癌预后的意义。鉴于此,我们进一步行体外实验,平板克隆实验结果显示在HCT15中,HOC的细胞克隆形成率低于HOC;细胞迁移实验结果显示HOC的迁移能力弱于HOC。以上体外功能实验结果显示,lnc-SERTAD1-1过表达抑制了结直肠癌细胞的增殖和迁移,提示lnc-SERTAD1-1可能对结直肠癌起抑癌作用。
本研究为了验证lnc-SERTAD1-1与SERTAD1之间可能存在正相关的关系,对HOC及HO进行了转录水平及蛋白水平的检测,结果提示,lnc-SERTAD1-1和下游蛋白SERTAD1在HO中的表达量均高于HOC,提示质粒成功导入HCT15中,且lnc-SERTAD1-1与SERTAD1存在正相关关系。目前,有关lnc-SERTAD1-1与结直肠癌关系的研究极少,lnc-SERTAD1-1在结直肠癌中的分子作用机制的研究更为罕见。本研究结果提示了lnc-SERTAD1-1可抑制结直肠癌细胞的增殖与迁移,其在结直肠癌中作为一种抑癌分子参与肿瘤发生、发展及转移是有可能的。
本研究尚存在一些不足,lnc-SERTAD1-1与临床病理特征的相关分析数据仅来源于单中心,应增加样本量,寻求多中心多地区合作,进行更具代表性的调查研究。本研究初步验证了lnc-SERTAD1-1对结直肠癌的抑癌作用,为深入研究结直肠癌发病及进展机制提供了理论依据,有望用于指导临床治疗及术后随访,但更深入的作用机制及临床应用尚待进一步研究。