骨性关节炎的发病率随着人口老龄化程度的增加明显增高,已经成为严重影响身体健康的疾病之一,其主要病理特点是关节软骨的破坏与缺损,因此关节软骨修复是骨性关节炎的治疗关键。骨髓间充质干细胞（BMSC）是一类来源于骨髓的具有多向分化潜能的干细胞,具有自我更新、组织再生和抗炎修复等功能[1]。研究表明BMSC在特定诱导条件下可以转化成软骨细胞,进而促进关节软骨损伤的修复[2]。BMSC来源广泛,体外培养可诱导类软骨细胞分化,是一种非常有前景的可应用于临床治疗软骨缺损修复的种子细胞[3]。自组装多肽纳米纤维水凝胶通过简单调节分子间电荷作用和氢键之间的平衡,使两亲性多肽聚集成了不同形态的组装体进而得到了具有等级结构的宏观多肽材料[4]。前期实验证明自组装多肽形成的水凝胶支架能够为细胞培养提供良好条件[5]。本研究将新西兰兔的BMSC接种至加载纳米质粒骨形态发生蛋白2（pBMP2）及环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（cRGDfK）功能性多肽支架上培养,研究自组装多肽形成的纳米级结构特征及BMSC在支架材料上的生长状态、生物相容性、向软骨细胞分化情况及软骨修复效果,为其进一步作为骨组织工程支架的体内研究提供实验依据。
材料与方法
一、实验动物
新西兰大白兔20只,雌性,兔龄（11.01± 1.03）月,体质量（5.12±1.21）kg,购自中山大学实验动物中心,本动物实验方案经中山大学动物实验伦理委员会批准（批件号2020d022）,所有操作均符合实验动物伦理要求。
二、主要材料和仪器
10%胎牛血清购自美国HyClone公司;高糖型DMEM培养基、谷氨酰胺购自美国Gibco公司;胰酶、0.02%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、青霉素链霉素双抗、β-甘油磷酸钠、地塞米松和CCK-8 检测试剂盒购自美国Sigma公司;逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒和TRIzol RNA抽提试剂购自美国Invitrogen公司,钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）活细胞/死细胞双染试剂盒购自中国尚宝生物。主要仪器包括低速离心机（Thermo,德国）、倒置显微镜（Olympus,日本）、超声波清洗机（科净达,中国）、原子力显微镜（Asylum Research,美国）,激光共聚焦荧光显微镜（Nikon,日本）,酶标仪（Varioskan Flash,美国）、实时PCR 仪（Bio-Rad,美国）、安捷伦 1100 高效液相色谱（HPLC）仪（Agilent,美国）、质谱仪（Finnigan LCQ,美国）、冷冻干燥机 （Labconco, 美国）。
三、方法
1. 多肽自组装水凝胶支架的制备和检测
设计2条携带pBMP2及cRGDfK软骨细胞特异性黏附肽的两亲性多肽,分别为PA1（C12 AAADDD-GAGAGAGY）和PA2（C12AAADDD-cRG DfK）,委托上海波泰公司用固相自动多肽合成仪合成;采用HPLC仪纯化并检测其纯度;质谱仪检测其平均分子量。根据文献[6]在无菌条件下取10 mg两亲性多肽粉末溶于400 μl 0.1 mol/L氢氧化钠溶液中;充分振荡混匀溶解,然后在37℃培养箱中温育1 h,直到粉末完全溶解。然后再继续添加无菌的双蒸水至多肽溶液总体积为1 ml,此时自组装多肽临界点为1%,多肽溶液呈黏稠状,放置4℃冰箱保存。凝胶纤维的制备是直接将pH 8的多肽溶液用1 ml的注射器注射至0.1 mol/L的盐酸溶液中,即得到白色的凝胶状纤维,利用扫描电镜检测支架结构,使用原子力显微镜观察自组装纳米多肽的纤维结构形态。
2. BMSC的分离和培养鉴定
将兔固定后消毒铺巾,利多卡因20 ml局部麻醉,利用骨穿穿刺针采集新鲜骨髓,按1∶3体积比加入10%胎牛血清、100 kU/L青霉素的DMEM细胞培养液,充分混匀后移入25 ml的Hank培养瓶中差速贴壁法培养,3 d后弃培养瓶中的油脂等杂质,然后每3 d换1次细胞培养液。待BMSC细胞融合率达70% ~ 80%后进行传代培养。采用流式细胞仪检测BMSC表面蛋白CD34、CD45、CD90和CD105的表达[7]。
3. 多肽自组装水凝胶与BMSC共培养
生物相容性检测（活细胞/死细胞双重染色）：配制 DMEM/F12培养液,滤膜过滤灭菌混合后涡旋5 s,加入BMSC混匀,调整浓度为2×106/ml细胞悬液,接种于有多肽自组装水凝胶的24孔板中,每孔100 μl,于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养72 h后,采用Calcein-AM/PI试剂进行染色,在荧光显微镜下观察活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）并且拍照记录,其中活细胞显示出黄绿色荧光,死细胞显示出红色荧光[7]。
使用CCK-8 法检测水凝胶上BMSC的增殖情况：在96孔培养板分别滴加50 μl工作液,成胶后分别在空白孔、多肽自组装水凝胶上滴加100 μl3×104/ml的第2代 BMSC细胞悬液。分为BMSC组、水凝胶组和BMSC复合水凝胶组,在培养6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d时,每组中各取1个孔加入1 μl CCK-8溶液,37℃孵育1 h,酶标仪检测 450 nm 吸光度;使用 GraphPad Prism 7.0软件绘制生长曲线图。
表1 引物序列 |
| 基 因 | 序 列 |
|---|---|
| β-actin | 上游5'-CCTCGCCTTTGCCGATCCGC-3' 下游5'-CCACCATCACGCCCTGGTGC-3' |
| AGN | 上游5'-AGTATCATCAGTCCCAGAATCTAGCA-3' 下游5'-AATGCAGAGGTGGTTTCACTCA-3' |
| COL2a1 | 上游5'-ACTGGGACTGTCCTCTGCGACG-3' 下游5'-TCTGTCCCTTTGGTCCTGGTTGC-3' |
| Sox-9 | 上游5'-CTCGGACACCGAGAACACGCG-3' 下游5'-CAGAAGTCTCCAGAGCTTGCCCAGC-3' |
4.体外软骨缺损修复实验
建立双侧膝髌股关节股骨髁部浅表层软骨缺损（软骨全层厚度的25%）兔模型,分组植入凝胶。取20只成年健康新西兰大白兔,随机分4组,每组5只。正常组手术显露关节后不造模,缺损对照组造模后不处理,水凝胶组造模后植入水凝胶支架,水凝胶载荷干细胞组在造模后植入水凝胶支架和BMSC复合物。造模：用水合氯醛静脉麻醉后,常规消毒铺无菌单,取膝关节正中侧切口,逐层切开皮肤、皮下软组织、浅深筋膜,显露膝关节股骨侧,使用口腔钻在其软骨层进行钻孔,形成长2.5 mm、宽1.0 mm、深1.5 mm 的锥形软骨缺损,生理盐水冲洗,进行相应干预后逐层缝合。3个月后将实验动物处死,取软骨缺损组织行甲苯胺蓝染色,应用国际软骨修复协会（ICRS）评分系统评估染色结果,评分越高代表修复效果越好[8]。
四、统计学处理
采用 SPSS 20.0处理数据,正态分布的计量资料以$\bar{x} \pm s$表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、自组装水凝胶的鉴定与观察
两亲性多肽设计及合成的检测：设计含pBMP2 及 cRGDfK 功能性多肽自组装水凝胶,用固相自动多肽合成仪合成;采用HPLC分析目标多肽出现3个峰值,见图1A。在Peak No.3时,Ret Time为19左右,面积（Area）最大,出现多肽洗脱最高峰,此时多肽纯度（Conc.）为96.70%;纯化后收集目标肽,然后冷冻干燥后行质谱仪检测其平均分子量为 3219,证实了与理论分子量设计是一致的,见图1B。其目标肽RGDK-\IKVAVAK-/KGGGGAAAAK-C16H31O 化学结构可见pBMP2 序列及 cRGDfK 序列2个肽链分支结构,见图 1C。水凝胶形成后,原子力显微镜下观察显示支架表面粗糙、凹凸不平,有利于细胞黏附和迁移,见图1D、E。
二、 BMSC的培养和鉴定
原代BMSC培养48 h后开始贴壁,细胞呈梭形或者多角形;培养至第2代后,细胞呈旋涡状或者辐射状生长,增殖迅速。取第3代生长状态良好BMSC,流式细胞仪检测CD34-FITC 和CD90-PE、CD45-FITC和CD105-PE单克隆抗体,以同型非特异性IgG-PE、IgG-FITC作阴性对照,CD90阳性和CD34阴性的比例为95.10%,CD105阳性和CD45阴性的比例为91.22%,即CD90和CD105高度表达,而CD34和CD45未能表达或表达极低水平,符合BMSC表面抗原表达,见图2。
三、水凝胶与BMSC的生物相容性及其对BMSC增殖及成软骨分化的影响
培养72 h后,荧光显微镜下观察兔BMSC 在自组装水凝胶中生长状态稳定,形态良好,轮廓清晰,分布均匀。细胞染色示以绿染的活细胞为主,只有极少数红染的死细胞,见图3A。CCK-8 检测细胞增殖结果显示,BMSC复合水凝胶组在培养3 d时吸光度高于BMSC,比较差异有统计学意义（t = 31.231,P < 0.001）,见图3B。空白组、水凝胶、CM组和水凝胶与CM混合组的AGN、COL2a1、Sox-9 mRNA表达在第2~4周比较差异均有统计学意义（FAGN = 245.135,PAGN < 0.001;FCOL2a1 = 57.254,PCOL2a1 < 0.001;FSox-9 = 247.154,PSox-9< 0.001）,其中有水凝胶的环境更有利于BMSC成软骨分化,见图3C。
四、兔软骨缺损模型大体观察及甲苯胺蓝染色分析
兔关节软骨缺损修复效果的大体观察及甲苯胺蓝染色分析显示,水凝胶载荷干细胞修复最理想,缺损对照组软骨缺损范围大、炎症细胞浸润多,水凝胶组软骨缺损范围较缺损对照组明显减少,水凝胶载荷干细胞组炎性细胞消失且和正常组形态基本相近。4组的ICRS评分比较差异有统计学意义（F = 99.537,P < 0.001）,干细胞载荷水凝胶组评分高于水凝胶组（LSD-t = 45.526、P < 0.001）及缺损对照组（LSD-t = 156.751,P < 0.001）,见图4。
讨论
本研究设计含pBMP2及cRGDfK 功能性多肽自组装水凝胶,用固相自动多肽合成仪合成并且证实与理论分子量设计是一致。原子力显微镜观察自组装多肽可以形成纳米纤维网状结构并且提供腔隙。倒置显微镜观察显示BMSC的生长良好。目前尚未发现BMSC抗原特异性表型标记,根据文献大致为阳性表达 CD90、 CD44、 CD34、 CD54、CD73、 CD29、 CD13、 CD146、 CD106和CD105,阴性表达 CD34、 CD31、 CD45、 CD49d、 CD14、 CD10 和 CD11b[12]。本研究取第3代BMSC行流式细胞仪检测表面抗原标志物,结果表明 CD90和CD105高度表达,而CD34和CD45未能表达或表达极低水平,与文献报道相符[13]。
细胞与材料的生物相容性是细胞在材料表面迁移、增殖与分化的前提[14]。本研究的BMSC与水凝胶共培养的双重染色显示以绿染的活细胞为主,只有极少数红染的死细胞,说明生物相容性良好。CCK-8法结果显示,BMSC复合水凝胶组在培养3 d时细胞增殖能力高于BMSC组,表明在特定的分化刺激培养条件下水凝胶支架有助BMSC向成软骨细胞分化。水凝胶本身由溶液转变为凝胶形态后并不具备特定的形状。在既往的研究中,水凝胶常用于腔隙型骨缺损的修复,本研究选择兔软骨缺损模型大体观察及甲苯胺蓝染色分析,结果显示水凝胶有利于关节软骨组织修复,并且自组装水凝胶载荷干细胞对修复关节软骨缺损效果更好。
综上所述,BMSC负载于多肽自组装水凝胶支架中可通过暴露于纳米纤维表面的cRGDfK环肽特异性黏附和募集间质干细胞诱导成软骨分化,从而有助修复关节软骨缺损。这种新型多肽纳米纤维水凝胶材料可为临床上骨关节炎的软骨损伤修复治疗提供新的研究方向。