常染色体及Y染色体-短串联重复序列（STR）已经常规用于司法鉴定,但是X染色体-STR（X-STR）基因座的应用研究相对较少[1]。X染色体具有独特的遗传特性：母亲可以传递给子女,而父亲仅传递给女儿且该染色体来自女儿的祖母,可作为常染色体多态性分析的重要补充,在复杂亲缘鉴定、男女混合样本检测以及部分伦理犯罪中有特殊的应用价值[2]。本研究选择的MicroreaderTM 19 X-STR复合扩增体系（MRX19）,遗传标记均分布在非连锁簇内,遗传标记间的遗传距离相距较远,符合独立遗传,但该复合扩增体系群体多态性报道少,尚未见法医应用评估报道。为此,研究收集了196份无关个体血样,检测了19个X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）及性别基因座,评估了该荧光复合扩增体系的种属特异性、灵敏度、抗抑制剂、精确性、可重复性、一致性与在混合样本、陈旧检材中应用效果及影子峰（Stutter峰）和群体多态性,并优化了扩增条件,现报告如下。
材料与方法
一、样本
种属特异性实验：选取仓鼠、狗、猴子、鸡、龙猫、猫、牛、猩猩、鸭、羊非人源DNA各0.5 ng,均来源于广州市公安局刑事科学技术研究所的科研积累。
抗抑制剂实验：将不同浓度的法医实践常见的抑制剂[血红素、靛蓝、腐殖酸、乙二胺四乙酸（EDTA）]加入到0.5 ng的9947A中。血红素的浓度梯度为0、75、125、150 μmol/L;靛蓝的浓度梯度为0、750、1500、2000 μmol/L;腐殖酸的浓度梯度为0、5、10、20 ng/μL;EDTA的浓度梯度为0、0.8、1.0、1.2 mmol/L。
男/女混合样本：通过混合标准品2800M和标准品9947A来实现的。分别按照1:1、1:4、1:9、1:19、19:1、9:1、4:1 和1:1的比例混合,每份混合样本的DNA总量均为1 ng。
分型一致性、陈旧检材实验的样本：来源于日常检案积累。
群体样本：根据知情同意原则,收集来自广东、广西、湖南及江西省的196份（男性样本123份,女性样本73份）中国南方汉族无关个体的血样。本实验涉及到生物实验等有关设计、实施方案及受试者征集过程符合中山医学院伦理原则（伦理批件号：中山医医伦[2020]第044号）。
二、主要试剂和仪器
主要试剂包括MicroreaderTM 19 X ID 荧光检测试剂盒及相应的QD550内标（购自阅微公司）、AGCUX19 STR荧光检测试剂盒及相应的SIZ-500内标（购自中德美联公司）和BK-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（购自博坤生物科技有限公司）[3]。主要仪器包括BK-TQ-001E 博坤全自动DNA提取工作站、Qubit®2.0 Fluorometer定量仪、ABI 9700型扩增仪、ABI 3500全自动遗传分析仪、ABI 3500XL全自动遗传分析仪和ABI 3130XL全自动遗传分析仪。
三、方法
1. DNA提取
前述所有样本采用BK-超微量磁珠法DNA提取试剂盒通过BK-TQ-001E全自动工作站提取基因组DNA,模板DNA均使用Qubit®2.0 Fluorometer定量仪进行浓度测定[4]。
2. DNA扩增
参照DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）的验证指南,评估MRX19的种属特异性、灵敏度、抗抑制剂性、精确性、可重复性、一致性与在混合样本、陈旧样本中的检测效果及Stutter峰和群体多态性[5]。其中特异性、灵敏度、分型一致性、混合样本、陈旧检材实验均使用25.0 μL体系：PCR反应液10.0 μL,引物混合液5.0 μL,MicroreaderTM Tap DNA PolymeraseⅡ 0.5 μL,模板DNA 1.0 μL,扩增水8.5 μL。PCR扩增使用ABI 9700型扩增仪,扩增循环参数设置为：变性95℃ 2 min,热循环94℃5 s,60℃ 70 s,29个循环,终延伸60℃30 min,4℃保温。
3. 电泳与分型
通过ABI 3130XL遗传分析仪进行毛细管电泳检测,样品制备：1.0 μL扩增产物与9.0 μL上样缓冲液混合。上样缓冲液包含8.5 μL Hi-Di甲酰胺以及0.5 μL内标。X-STR基因分型通过GeneMapperID-X软件完成,包括19个X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）。
四、统计学处理
使用SPSS 25.0对男、女群体之间各基因座的等位基因频率分布差异进行χ2检验。应用Arlequin 3.5对女性样本分型数据进行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验和各基因座间进行连锁不平衡检验。使用在线X-STR数据库（ http://www.chrx-str.org/）计算该19个X-STR的法医学应用参数。通过收集19个X-STR荧光检测体系Allelic Ladder电泳的16个通道的电泳数据计算每个等位基因片段的电泳迁移率。Stutter比率为Stutter峰高与相应等位基因峰高的比值。α = 0.05,多重比较采用Bonferroni法。
结果
一、种属特异性验证
检测猩猩、猴子、牛、羊、狗、鸡、鸭、龙猫、猫和仓鼠的样本,除猩猩的样本检测到非特异性扩增片段之外,其它物种均未发现扩增片段。
二、灵敏度实验
使用9947A梯度稀释模板量分别为1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.0312 50 ng进行扩增检测。19个X-STR完整分型的最低模板量为0.25 ng。
三、抗抑制剂实验
血红素、靛蓝、腐殖酸和EDTA 4种抑制剂对该检测系统检出完整等位基因分型干扰浓度分别为125 μmol/L、750 μmol/L、5 ng/μL、0.8 mmol/L。
四、精确性实验
通过使用3500XL遗传分析仪（容忍范围0.50 bp）上电泳24份等位基因分型标准物并统计片段迁移率,虽然基因座DXS7423和HPRTB表现出较大迁移率,但是两者的迁移率均在0.20 bp之内,没有超出遗传分析仪的容忍范围,见图1。
五、可重复性实验
不同组织男、女样本各1份,分别使用3台不同仪器（3500、3500XL、3130XL）进行电泳检测,每组重复3次,均得到一致结果,峰高均在1500 rfu以上。
六、一致性实验
196份群体样本中与AGCU 19X STR试剂盒共有的7个基因座（DSX10079、DXS101、DXS10135、DXS10162、DXS6809、DXS7423、HPRTB）均得出相同的基因分型。
七、混合样本实验
通过混合标准品2800M和标准品9947A进行检验,在1:1混合的样本中检出完整基因分型,但小于或等于1:4时,DNA含量低的样本出现遗传标记丢失,丢失的片段主要为长片段。
八、陈旧检材实验
选取12份陈旧血样,同步使用MRX19与AGCU X19试剂盒进行检验。12份样本所有基因座全部得到完整分型,表明MRX19检出效能较高,并与AGCU X19荧光检测试剂盒进行比较,分型结果一致。
九、PCR优化
1. 循环数梯度
使用25 μL体系对0.5 ng 9947A进行扩增,设置5个循环数目梯度,分别为27、28、29、30 和31。荧光峰值随着循环数的增加而升高,循环数为27时可以得到完整基因分型,样本在29个扩增循环数时,各基因座扩增的荧光均衡性更好,而当循环数超过30时由于荧光峰值过高,个别基因座出现荧光渗透现象,影响相同片段大小的其他等位基因的分型。
2. 退火温度梯度
以56、58、60、62、64 ℃的5个温度梯度对体系的退火温度耐受性进行测试,均能得到完整的基因分型,且60 ℃时产物片段荧光峰值和特异性最好,除64 ℃时DXS6807基因座杂合子峰高比为0.207,其余温度时该体系14个基因座的杂合子峰高比均在0.6~1.0,均衡性较好,见图2。
3. 终延伸时间梯度
取0、15、30、45、60 min 5个时间梯度进行扩增。当延伸时间高于15 min时,目的峰没有减A峰出现,高于30 min时处于稳定,因此该体系最佳延伸时间设置为30 min。
十、Stutter峰研究
统计了50个南方汉族无关个体的样本数据从而得出每个基因座的Stutter范围并进一步加权分析后算出Stutter峰值,结果显示19个X-STR基因座的Stutter峰平均比率均低于15%。
十一、群体多态性检测
检测196份无关个体19个X-STR基因座均符合H-W平衡（P > 0.05/19）,且19个X-STR基因座相互之间未出现连锁不平衡状态（P > 0.05/171）。杂合度观察值（Ho）为0.3151~0.9178,杂合度期望值（He）为0.2927~0.9249,多态性信息含量（PIC）为0.2633~0.9173,其中PIC最为丰富的基因座为DXS10135。此外,DXS10135、DXS10079、DXS6809、DXS10162、DXS981、GATA31E08、DXS101等7个基因座的PIC均大于0.7。另外,男性群体中的累积个体识别能力（TDP）大于0.999 999 999 874,女性群体中的TDP大于0.999 999 999 999。累积平均排除概率（MEC）在三联体案件中大于0.999 999 999 298,在二联体案件中大于0.999 999 500 495。共检出151个等位基因,基因频率分布在0.0037~0.8439之间。等位基因数目最多的DXS10135检出21个等位基因,等位基因数目最少的DXS7423仅有4个等位基因被检出,见表1。
表1 196份血样19个X-STR基因座的法医学参数 |
| 基因座 | χ2值 | P值 | Ho | He | PIC | PD男性 | PD女性 | MEC三联体 | MEC二联体 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| DXS6795 | 0.833 | 1.000 | 0.6575 | 0.6782 | 0.6398 | 0.7028 | 0.8402 | 0.6398 | 0.4946 |
| DXS6803 | 2.667 | 0.849 | 0.6301 | 0.6885 | 0.6576 | 0.6828 | 0.8669 | 0.6576 | 0.5132 |
| DXS6807 | 3.000 | 0.964 | 0.6986 | 0.6398 | 0.5698 | 0.6344 | 0.7999 | 0.5698 | 0.4225 |
| DXS9907 | 1.333 | 0.998 | 0.5890 | 0.6261 | 0.5324 | 0.5887 | 0.7876 | 0.5324 | 0.3891 |
| DXS7423 | 0.000 | 1.000 | 0.4384 | 0.5160 | 0.4217 | 0.4799 | 0.6906 | 0.4217 | 0.2851 |
| GATA172D05 | 0.000 | 1.000 | 0.7945 | 0.7275 | 0.6893 | 0.7168 | 0.8925 | 0.6893 | 0.5487 |
| DXS101 | 4.000 | 0.998 | 0.8630 | 0.8047 | 0.7675 | 0.7798 | 0.9350 | 0.7675 | 0.6416 |
| DXS9902 | 0.833 | 1.000 | 0.7123 | 0.6849 | 0.6030 | 0.6417 | 0.8396 | 0.6030 | 0.4567 |
| DXS7133 | 1.200 | 0.977 | 0.3836 | 0.3334 | 0.3134 | 0.3620 | 0.5241 | 0.3134 | 0.1936 |
| DXS6810 | 6.571 | 0.583 | 0.5205 | 0.6136 | 0.5467 | 0.6085 | 0.7852 | 0.5467 | 0.3990 |
| GATA31E08 | 0.000 | 1.000 | 0.7534 | 0.7728 | 0.7139 | 0.7214 | 0.9156 | 0.7139 | 0.5777 |
| DXS6800 | 2.667 | 0.914 | 0.3151 | 0.2927 | 0.2633 | 0.2577 | 0.4872 | 0.2633 | 0.1572 |
| DXS981 | 5.200 | 0.971 | 0.7260 | 0.8105 | 0.7995 | 0.8293 | 0.9381 | 0.7995 | 0.6823 |
| DXS10162 | 11.500 | 0.646 | 0.7260 | 0.7999 | 0.7734 | 0.8023 | 0.9307 | 0.7734 | 0.6488 |
| DXS6809 | 3.667 | 0.997 | 0.8219 | 0.7913 | 0.7642 | 0.7871 | 0.9272 | 0.7642 | 0.6380 |
| GATA165B12 | 3.000 | 0.934 | 0.7123 | 0.6200 | 0.5601 | 0.6066 | 0.7906 | 0.5601 | 0.4118 |
| DXS10079 | 6.600 | 0.922 | 0.8630 | 0.8184 | 0.7904 | 0.8044 | 0.9427 | 0.7904 | 0.6705 |
| DXS10135 | 16.286 | 0.433 | 0.9178 | 0.9249 | 0.9173 | 0.9124 | 0.9894 | 0.9173 | 0.8524 |
| HPRTB | 0.857 | 1.000 | 0.7260 | 0.7436 | 0.6816 | 0.6939 | 0.8927 | 0.6816 | 0.5407 |
讨论
本研究参照SWGDAM的验证指南,对MRX19进行法医学应用评估。种属特性实验结果显示,仅来源于猩猩DNA的样本出现了非特异扩增片段,而其他样本均未出现扩增片段,表明该体系具有较好的种属特异性。该体系在模板量大于等于0.025 ng可获得完整分型,显示灵敏度高。12份陈旧、微量检材全部得到完整基因分型,显示该体系可用于案件检材。在抗抑制试验中,加入法医实践中常见的抑制物血红素、靛蓝、EDTA等,结果显示该体系对抑制剂有较好的耐受性。
PCR循环数优化实验结果表明,该体系在循环数为27的PCR体系中可以得到完整基因分型,循环数为29时各基因座扩增均衡性最佳,而当循环数超过30时会产生荧光渗透现象。退火温度优化实验中,该体系在56~64℃均能得到完整的基因分型, 60℃时PCR效率最高,即产物片段荧光峰值和特异性最好。本实验数据为该扩增体系在实际应用中进一步优化提供了借鉴。
在法医学实践中,由于X-STR特有的遗传特征,常被作为重要的技术手段应用于复杂亲权鉴定及男女混合样本检测。然而目前应用的X-STR检测试剂盒主要为德国Qiagen公司基于国外人群数据开发的试剂盒,可检出12个X-STR遗传标记,遗传标记数目少,集中在4个连锁簇内,除了价格较高以外该试剂盒检测中国人群基因多态性的灵敏度较低[6]。因此,研发基于中国人群基因多态性的新型X-STR试剂盒有非常重要的意义。中德美联的AGCU X19荧光检测体系能检测19个X-STR,优势为位点较多,经过应用验证并获得较多中国群体法医学应用参数,能比较清晰了解其中的连锁重组关系,基因座主要分布在7个连锁簇内,计算复杂亲缘关系时可以更精准地计算似然率值[7,8]。本次研究的196份样本中,MRX19与AGCU X19荧光检测体系在共有的7个基因座获得相同的基因分型,提示MRX19分型准确性高。MRX19的优势是X-STR基因座间遗传距离较远,基本认为独立遗传,在本次实验中使用女性样本的分型数据进行连锁不平衡检验,结果显示所有基因座的组合均未发现连锁不平衡状态（P均 > 0.05/171）,表明该群体在此19个X-STR基因座的等位基因频率及基因型频率处于遗传平衡状态,内部各基因座的遗传是相互独立的。
另外,MRX19体系全部19个X-STR基因座的男、女性等位基因分布比较差异均无统计学意义,故将男女性进行合并计算。女性样本的所有基因座均符合H-W平衡。该体系的累积个体识别能力在男性群体中大于0.999 999 999 874,在女性群体中大于0.999 999 999 999;在三联体案件中的累积平均排除概率大于0.999 999 999 298,在二联体中的累积平均排除概率大于0.999 999 500 495,结果表明该检测体系具有良好的多态性,单独使用这套遗传标记可以获得较高的个体识别率;配合连锁簇内的X-STR遗传标记使用,在计算复杂亲缘关系时可获得更高的准确性,该体系适用于法医个体识别及补充复杂亲缘关系的鉴定。