间充质干细胞（MSC）具有自我更新、多能分化和免疫调节的作用。近年研究显示,MSC可在包括变应性结膜炎、变应性鼻炎、急性青光眼、阿尔茨海默病和1型糖尿病等多种疾病中发挥治疗作用[1⇓⇓⇓⇓-6]。MSC可以从不同的组织中分离出来,包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织和人的牙龈[7]。牙龈MSC（GMSC）是一种从牙龈组织中获得的MSC亚群,2009年Zhang等首次从人牙龈组织中分离出GMSC,并证实了其表型及功能活性[8]。与其他MSC类似,GMSC也具有抑制炎症和调节免疫反应的作用。小鼠和人源化动物模型研究显示,GMSC能够通过减少效应性T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、破骨细胞和增加调节性T淋巴细胞等治疗包括类风湿关节炎、1型糖尿病、SLE、动脉粥样硬化等多种疾病[7, 9-14]。既往文献提及的小鼠GMSC的提取方法需使用多种酶及复杂的培养基等[15-16]。本研究以C57BL/6小鼠进行实验,旨在建立更为简便、高效的GMSC体外提取及培养体系,现报道如下。
材料与方法
一、动物
SPF级C57BL/6小鼠5只,雌雄不限,8~10周龄,体质量15~20 g,购自广东省医学实验动物中心。实验过程中严格遵循减少、替代、优化的伦理规范操作,做到充分考虑动物的利益,善待动物,防止或减少动物的应激、痛苦和伤害,尊重动物生命,采取痛苦最少的方法处置动物。
二、主要试剂
包括：α-MEM培养基、青霉素-链霉素双抗溶液、胎牛血清（FBS）,均购自美国Gibco公司;Ⅳ型胶原酶、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、人胰岛素、油红O染液,均购自美国Sigma公司;细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（CCK-8法）购自美国APExBio公司;结晶紫染液、茜素红染液,均购自上海碧云天生物技术有限公司;抗小鼠流式抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105,均购自美国BD公司。
三、培养液配制
原代细胞培养液为α-MEM培养基+20%FBS。完全培养液为α-MEM+10%FBS。成脂诱导液为α-MEM培养基+10%FBS+200 μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰岛素+1 μmol/L地塞米松+500 μmol/LIBMX。成骨诱导液为α-MEM+10%FBS+10 nmol/L地塞米松+50 mg/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠。
四、实验方法
1. 小鼠GMSC的分离培养
处死C57BL/6小鼠,取小鼠下颌骨,清除多余皮肤及肌肉组织,用含有5%双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗下颌骨多次。用注射器针头轻轻分离磨牙区牙龈。收集分离到的组织于培养皿中,加入1 mg/L Ⅳ型胶原酶,于37 ℃中消化30 min,加入含有 FBS的α-MEM终止消化,离心,弃上清。将组织铺于6孔板中,每孔加1 mL含20%FBS的α-MEM,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待2~3 d后细胞爬出,换液把剩余组织块洗出,每孔加2 mL 20%FBS的α-MEM,3 d换1次液。细胞长满板底80%后传代,传代后更换为含10%FBS的完全培养液继续培养。
2. 小鼠GMSC的增殖能力检测
按细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（CCK-8法）说明书进行操作,连续8 d在同一时间使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度,根据结果绘制GMSC生长曲线。
3. 小鼠GMSC的表面标志物流式细胞术检测
将第2代 GMSC（约1×106个细胞）细胞悬液用PBS洗涤2次,用100 μL PBS重悬后分别加入流式抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105,4℃避光孵育20 min后,PBS洗涤3次,流式细胞仪检测上述细胞表面标志物的表达。
4. 小鼠GMSC的多向分化潜能诱导
成脂诱导分化：取第2代GMSC接种于6孔板,每孔约3×103个细胞,待细胞铺满板底70%,更换培养液为成脂诱导液,每隔3 d换1次液。诱导21 d后,PBS洗涤细胞1次,4%多聚甲醛固定30 min,去离子水洗涤2次后油红O染液染色20 min,蒸馏水清洗3次,干燥后倒置显微镜下观察并拍照。
成骨诱导分化：取第2代GMSC接种于6孔板,每孔约3×103个细胞,待细胞铺满板底70%,更换为成骨诱导液,每隔3 d换1次液。诱导28 d后,PBS洗涤细胞1次,4%多聚甲醛固定30 min,去离子水洗涤2次后茜素红染液染色30 min,蒸馏水清洗3次,干燥后倒置显微镜下观察并拍照。
五、统计学处理
应用GraphPad Prism 8软件进行数据分析。数据均符合正态分布,以 表示,组间比较采用t检验,多个时间点的比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、小鼠GMSC的分离培养结果
二、小鼠GMSC的增殖能力检测结果
CCK-8法结果显示,GMSC在第3~4日增长最快,在第5~8日增长变得缓慢,出现平台期。普通光学倒置显微镜下可见GMSC在第3~4日数量增长明显,在第5~8日数量逐渐到达最大值,并进入平台期。各时间点的变化组间比较差异有统计学意义（F = 339.90,P < 0.001）, 其中第0~2日、第5~8日的相邻时间点比较差异无统计学意义（P均> 0.05）,第2~5日相邻时间点比较差异均有统计学意义（P均< 0.05）,见图2。
三、小鼠GMSC的细胞表面标志物流式细胞术检测结果
小鼠GMSC高表达CD29、CD44、CD90、CD105,最高的表达率达90%及以上,CD73最高表达率高于70%,CD39最高表达率为26.3%,同时结果显示所提取细胞几乎不表达CD34、CD45,表达率均低于5%,说明所提取的细胞纯度较高。以小鼠口腔黏膜上皮细胞为对照细胞,可见GMSC的CD29（t = 2.686,P = 0.036）、CD44（t = 22.582,P < 0.001）、CD73（t = 3.183,P = 0.019）、CD90（t = 62.944,P < 0.001）、CD105（t = 8.590,P < 0.001）、CD39（t= 5.799,P < 0.001）的表达均高于对照细胞,两者CD34（t = 1.572,P = 0.140）、CD45（t = -1.643,P = 0.151）表达相似,见图3。
四、小鼠GMSC的成脂诱导及鉴定结果
小鼠GMSC经成脂诱导液培养21 d后,分化为脂肪细胞并分泌出脂滴,经油红O染液染色后,在光学显微镜下可见葡萄串状红色脂滴形成,见图4。
五、小鼠GMSC的成骨诱导及鉴定结果
讨论
目前,小鼠等动物GMSC的提取方法为组织消化法或组织块法：组织消化法使用胶原酶和分离酶消化分离的组织块,再通过过滤器获得单细胞悬液进行种板,操作步骤繁杂,且多种酶的消化易对原代GMSC造成损伤,导致细胞提前分化失去其生物学特性;组织块法则将冲洗无菌的组织块直接种板,通过倒立培养瓶的方法获取原代细胞,该法提取细胞数量少、效率低且成功率不稳定[15]。
本研究将2种提取原代GMSC的方法相结合并加以改良,对分离的牙龈组织仅用Ⅳ型胶原酶消化半小时,然后把消化后的牙龈组织直接种板,2~3 d后可见细胞爬出。由此可见该改良方法具有以下优点：①步骤过程简单、易操作;②仅用一种消化酶,减短了消化时间,不仅减少了消化酶对原代细胞的损伤,而且节约了试剂成本;③经胶原酶处理的牙龈组织变软后再进行种板,更有利于种板后GMSC从组织中爬出,短时间内有较高的细胞获得率,节约时间成本,同时通过换液、传代可进一步纯化细胞;④培养液成分更为简单。与组织消化法及组织块法相比,新的提取GMSC方法更为简便、易行,见表1。
表1 小鼠GMSC的3种分离培养方法比较 |
| 项 目 | 组织块法 | 组织 消化法 | 改良 法 |
|---|---|---|---|
| 时间成本 | 高 | 低 | 低 |
| 试剂成本 | 中 | 高 | 低 |
| 操作复杂性 | 一般 | 复杂 | 简便 |
| 成功率 | 低 | 一般 | 高 |
| 细胞得率 | 低 | 高 | 高 |
| 第4代后细胞稳定性 | 稳定 | 细胞变性 | 稳定 |
本研究中小鼠GMSC生长曲线从一定程度上可反映GMSC的增殖规律,第3~4日增殖活跃,第5日始增殖进入平台期,第7~8日由于培养时间过长细胞生长过密,细胞开始出现凋亡,数量有少许下降。本研究所提取的细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD105,最高表达率均高于90%,CD73最高表达率高于70%,基本不表达造血细胞的细胞表面标志物CD34、CD45,最高表达率均低于5%,符合GMSC细胞标志物特性,同时提示所取取的细胞纯度较高。多向分化诱导实验中,小鼠GMSC在各自特定诱导条件下成功分化成对应组织,证实了GMSC的多向分化功能。本研究表明,改良法提取的GMSC具有快速增殖的优点,同时通过该法所分离的细胞有较高的纯度,且能表现多向分化的干细胞特性,因此该法提取GMSC是可行的。