食管癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一,发病率和病死率均居高不下[1⇓-3]。转移是食管癌高病死率的主要原因之一[4]。中性粒细胞和淋巴细胞是机体含量最多的先天性免疫细胞,与食管癌患者的临床预后密切相关[5]。近年来的研究表明中性粒细胞胞外诱捕网（NET）在肿瘤的局部生长和远处转移过程中扮演了重要角色[6]。Zhang等[7]的研究证实术前肿瘤中NET含量的增加与食管癌患者的不良预后密切相关。但尚未见NET生成与食管癌远处转移的研究报道,因此,本研究将检测食管癌患者外周血中NET含量,采用logistic回归分析和受试者操作特征（ROC）曲线评价NET生成的相关指标对食管癌远处转移的预测价值,旨在为食管癌的防治提供新视角。
对象与方法
一、研究对象
前瞻性选取2020年1月至2021年12月在本院就诊的60例中晚期食管癌患者为研究对象,根据是否发生远处转移将其分为非远处转移组（35例）和远处转移组（25例）。纳入标准：①成年人（年龄 ≥18周岁）;②经纤维胃镜及病理组织学检查确诊食管癌。排除标准：①合并严重血液疾病;②合并其他恶性肿瘤;③合并感染;④合并严重的难以控制的糖尿病。匹配30名同期在本院进行体检的健康志愿者作为对照组。本研究获得本院伦理委员会批准（意见号：伦申2022文112）。所有入组者均对本研究知情同意,并签署知情同意书。3组的基本资料具可比性,见表1。
表1 2组食管癌患者与健康志愿者基本资料比较 |
| 项 目 | 对照组 （30例） | 非远处转移组 （35例） | 远处转移组 （25例） | F/ χ2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 年龄/岁 | 66.70±6.04 | 67.37±6.81 | 66.52±6.67 | 0.148 | 0.863 |
| 性别/（男/女,例） | 20/10 | 22/13 | 18/7 | 0.549 | 0.760 |
| 吸烟/（有/无,例） | 15/15 | 20/15 | 16/9 | 1.094 | 0.579 |
| 酗酒/（有/无,例） | 21/9 | 28/7 | 20/5 | 1.118 | 0.572 |
| 高血压/（有/无,例） | 12/18 | 18/17 | 10/15 | 1.131 | 0.568 |
| 糖尿病/（有/无,例） | 18/12 | 22/13 | 17/8 | 0.381 | 0.826 |
| 心脏病/（有/无,例） | 14/16 | 15/20 | 13/12 | 0.490 | 0.783 |
| 肿瘤类型/（鳞癌/腺癌,例） | - | 29/6 | 20/5 | 0.080 | 0.778 |
| TNM分期/（Ⅱ~Ⅲ期/Ⅳ期,例） | - | 35/0 | 0/25 | 60.000 | < 0.001 |
二、双抗体夹心法检测外周血中NET[髓过氧化物酶（MPO）-DNA]含量
采用EDTA抗凝管采集患者外周静脉血2 mL,在室温条件下600×g离心10 min,收集上清液,采用双抗体夹心法检测NET含量。具体方法如下：将抗MPO单克隆抗体（购自Merck Millipore Corp公司）包被于96孔培养板中,置于4℃冰箱孵育过夜。用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗洗涤3次后加入5%牛血清白蛋白（BSA）,室温封闭2 h。用PBS洗涤后加入上述上清液标本,室温孵育2 h。再次洗涤3次后加入辣根过氧化物酶偶联的抗DNA单克隆抗体（DNA-HRP, 购自Roche Diagnostics的细胞凋亡ELISA 检测试剂盒）,室温孵育2 h。洗涤3次,加入二铵盐,避光室温孵育1 h。在多功能酶标仪中检测吸光度（OD405）,用其表示外周血NET含量。
三、中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）
收集3组的中性粒细胞计数和淋巴细胞计数,计算NLR,公式为NLR=中性粒细胞计数/淋巴细胞计数。
四、统计学处理
采用SPSS 20.0进行数据分析,符合正态分布的计量资料采用$\bar{x}±s$表示,组间比较采用独立样本t检验（2组）或单因素方差分析（3组及以上）;3组以上数据间的两两比较采用LSD法。非正态分布计量资料采用中位数（四分位数间距）表示,组间比较采用非参数检验。计数资料采用例（%）表示,组间比较采用χ2检验。采用Spearman相关分析探讨外周血NET含量与食管癌转移的相关性,采用Pearson相关分析探讨NET含量与NLR的相关性;采用logistic回归分析外周血NET含量是否为食管癌远处转移的危险因素;采用ROC曲线评估外周血NET含量对食管癌远处转移的预测价值,并计算曲线下面积（AUC）。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、外周血NET含量与食管癌远处转移密切相关
与对照组相比,食管癌患者外周血NET （MPO-DNA）含量和NLR均升高,且远处转移组高于非远处转移组（NET：F = 61.486,P < 0.001;NLR：F = 38.123,P < 0.001）,见表2。
表2 不同组研究对象外周血NET含量及相关中性粒细胞指标的差异 |
| 组 别 | 例数 | NET含量 | NLR值 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 30 | 0.62±0.23 | 1.44±0.45 |
| 非远处转移组 | 35 | 0.97±0.19 | 2.15±0.49 |
| 远处转移组 | 25 | 1.25±0.22ab | 2.38±0.26ac |
| F值 | 61.486 | 38.123 | |
| P值 | <0.001 | <0.001 |
注：与对照组相比,aP < 0.001;与非远处转移组相比,bP < 0.001;与非远处转移组相比,cP = 0.039。 |
Spearman相关分析结果显示：外周血中NET含量（r = 0.770, P < 0.001）和NLR（r = 0.6943, P < 0.001）均与食管癌远处转移密切相关。Pearson相关分析结果显示：食管癌患者外周血NET含量和NLR亦密切相关（r = 0.404, P = 0.001）。
二、外周血NET生成是食管癌远处转移的独立危险因素
以食管癌是否远处转移为因变量,以外周血NET含量和NLR为自变量进行多因素logistic回归分析,结果显示：患者外周血NET含量升高是食管癌发生远处转移的独立危险因素。见表3。
表3 食管癌转移患者危险因素的多因素logistic回归分析 |
| 变 量 | B值 | SE值 | Wald值 | P值 | OR值 | 95%CI |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 外周血NET含量 | 6.956 | 1.921 | 13.112 | < 0.001 | 1049.592 | 24.313~45310.558 |
| NLR | 1.305 | 0.776 | 2.833 | 0.092 | 3.689 | 0.807~16.868 |
| 常量 | -11.041 | 3.006 | 13.488 | - | - | - |
三、外周血NET生成对食管癌远处转移的预测价值
四、食管癌远处转移的亚组分析
根据ROC曲线分析的NET和NLR的截断值将食管癌患者分为2组,分别对2组患者远处转移率进行分析,结果显示：外周血NET含量 ≥1.13的食管癌患者远处转移率高于NET含量 < 1.13患者（P < 0.001）;NLR≥2.18的食管癌患者远处转移率高于NLR < 2.18患者（P < 0.05）。见表5。
表5 食管癌远处转移的亚组分析 |
| 项 目 | 总例数 | 转移例数 | 转移率/% | χ2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 外周血NET含量 < 1.13 | 32 | 6 | 18.75 | 14.816 | < 0.001 |
| 外周血NET含量 ≥1.13 | 28 | 19 | 67.86 | ||
| NLR < 2.18 | 35 | 10 | 28.57 | 5.927 | 0.015 |
| NLR ≥ 2.18 | 25 | 15 | 60.00 |
讨论
随着对肿瘤发生和发展规律的深入研究,学者们发现全身炎症反应在肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色[8]。中性粒细胞可以分泌血管生长因子,促进肿瘤血管生成,加快肿瘤生长速度[9]。淋巴细胞是机体抗肿瘤的重要细胞之一,参与肿瘤细胞的凋亡过程[10]。NLR反映机体炎性反应和抗炎反应之间的平衡,是预测炎症性疾病预后的重要指标[11]。近年来的研究亦表明NLR与食管癌临床病理特征及预后密切相关,可以作为食管癌和重症胰腺炎患者预后的评估指标[5, 12-15]。本研究亦提示术前外周血NLR≥2.18的食管癌患者发生转移的风险高于NLR < 2.18患者。但NLR预测食管癌的AUC、灵敏度和特异度均不佳,不适宜用于临床诊断。分析其原因主要为中性粒细胞和淋巴细胞计数的影响因素众多,因此不能真实反映肿瘤的转移情况。
NET是中性粒细胞捕杀入侵病原微生物的重要手段,然而近年来的研究显示NET与多种肿瘤的发生和发展密切相关。Ho-Tin-Noé等（2009年）在肺癌小鼠体内发现肿瘤组织中存在肿瘤相关的中性粒细胞和细胞外染色质的积聚,提示NET在肿瘤组织中存在的可能[16]。Berger-Achituv等（2013年）首次观察到肿瘤组织内NET生成量的增加与尤因肉瘤患者不良预后有关[17]。随后,越来越多的证据表明NET通过促进肿瘤细胞离开原发部位、降解细胞外基质、捕获循环中的肿瘤细胞、诱导上皮间质化和促进血管生成来影响肿瘤的远处转移[18]。Zhang等（2020年）的研究证实了术前肿瘤组织中NET含量的增加与食管癌患者不良预后密切相关[7]。但目前尚不清楚NET生成在食管癌转移中的作用。
本研究显示,食管癌患者外周血NET含量增加,且发生转移患者外周血NET含量高于未转移患者。进一步研究显示外周血NET生成是食管癌远处转移的独立危险因素,检测其含量能够预测食管癌转移的发生,且其诊断价值优于NLR;联合两者可以提高诊断的灵敏度和特异度。分析其原因主要考虑以下2个方面：首先,食管癌患者体内会形成一定的肿瘤微环境,大量的中性粒细胞被招募进入肿瘤微环境中,在多种因素刺激下形成NET,NET通过与肿瘤细胞的相互作用促进肿瘤细胞的转移。其次,肿瘤细胞所产生的各种因子作用于骨髓造血系统,导致外周血中性粒细胞计数显著增加。
综上所述,本研究证实了NET生成是食管癌转移的危险因素,检测外周血NET含量能够预测食管癌转移,联合NLR能够提高NET的预测价值。但本研究是单中心的小样本研究,病例数较少,其结果需要多中心大样本的研究来进一步验证。