感染后肠易激综合征（PI-IBS）， 是肠易激综合征（IBS）的重要类型和研究热点[1]。PI-IBS的发病机制目前尚不十分明确，报道表明肠道感染引起的黏膜炎症反应和免疫功能激活可能是PI-IBS发病的重要因素[2⇓-4]。微RNA（miR）-142-3p是一种在结直肠等多种组织器官中高表达的miRNA，对炎症反应具有重要的调控作用。我们对miR测序数据进行分析时发现，表达差异显著的miR-142-3p可能可以作为PI-IBS的生物学标志物。前期临床实验表明，与正常人群的样品相比，PI-IBS患者样品中miR-142-3p水平明显下调，提示miR-142-3p与PI-IBS发生发展有密切关系。本研究拟进一步在动物实验方面探讨miR-142-3p在PI-IBS中的表达及意义，阐明miR-142-3p调控PI-IBS发生发展的分子机制，为PI-IBS的临床治疗提供理论依据和治疗手段。
材料与方法
一、实验材料与试剂
miR-142-3p、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和Toll样受体4（TLR4）引物（北京擎科生物科技有限公司），HMGB1小干扰RNA（siRNA）及阴性对照（广州艾基生物技术有限公司），脂多糖（LPS）、胃蛋白酶（美国 Sigma 公司），磷酸盐缓冲液（PBS）（上海碧云天生物技术有限公司）， 原代肠上皮细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），TRIzol 试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），转染试剂（深圳市达科为生物技术股份有限公司）。
二、 PI-IBS大鼠模型建立
1. 实验动物
10只SD雄性大鼠由深圳市人民医院动物中心提供，鼠龄6~7周，体质量23~26 g，所有大鼠饲养在恒温、恒湿的清洁级动物房，光线调整为12 h日/夜循环。采用旋毛虫感染建立PI-IBS大鼠模型，采用旋毛虫造模过程如下：将旋毛虫保种大鼠乙醚麻醉后，颈椎脱臼处死，剔取四肢及膈肌肌肉。将肌肉尽量剪碎后置于500 mL含有2.5%胃蛋白酶和0.5%盐酸的消化液中，置于37 ℃水浴消化 12~20 h。反复将消化后混合液经 200 目滤布过滤收集旋毛虫幼虫。将滤液收集 500 r/min，10 min离心，弃上清，重悬于pH为7.2~7.4的PBS，计数调整浓度至1500只/mL。给予每只大鼠0.2 mL含350~400条幼虫的琼脂悬液灌胃，感染后饲养8周，建立PI-IBS模型。本动物实验伦理经深圳市人民医院审批通过（医院伦理编号：LL-KY-2021248）。
2. siRNA 转染实验
原代肠上皮细胞培养于12孔板中。细胞达到60%~80%汇合度时，用jetPRIME®转染试剂开展siRNA转染实验。首先取10 μL的HMGB1 siRNA （10 nmol）及阴性对照 siRNA（10 nmol）添加到100 μL jetPRIME® buffer 中，涡旋10 s，离心10 s，随后向混合液中加入3 μL jetPRIME®转染试剂，涡旋振荡后，室温静置10 min。随后将混悬液滴加到细胞中，置于培养箱继续培养24 h。随后用 LPS （500 ng/mL）及miR-142-3p处理细胞24 h，最后收集肠上皮细胞总RNA。
3. 实时荧光定量PCR检测
检测细胞中miR-142-3p、HMGB1和TLR4 mRNA的表达水平：提取肠上皮细胞细胞总RNA：使用TRIzol试剂盒进行提取。cDNA合成：根据反转录试剂盒说明书操作。miR-142-3p引物序列：正向引物为5′-GGGTGTAGTGTTTCCTAC-3′，反向引物为5′-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3′。HMGB1引物序列：正向引物为5′-AGGATCCCAATGCACCCAAGAG-3′，反向引物为5′-TTCGCAACATCACCAATGGACAG-3′。TLR4引物序列：正向引物为5′-GGTCAGACGGTGATAGCGAG-3′，反向引物为5′-GGTCCAGGTTCTTGGTTGAG-3′。qRT-PCR反应：a 反应条件：SYBR Green（2×）5 μL/孔，cDNA 2 μL/ 孔，正反向引物各 0.5 μL/ 孔， ddH2O 2 μL/ 孔;b 反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（35 次循环）。反应结束后导出数据，采用2-ΔΔCt法计算miR-142-3p、HMGB1和TLR4 mRNA相对表达量。
三、统计学处理
采用SPSS 22.0统计软件。所有实验数据均以 表示，组间比较采用t检验或非参数检验（Mann-Whitney U检验）进行统计分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
结果
一、miR-142-3p在肠上皮细胞中具有抗炎作用
基于miR-142-3p可能与HMGB1-TLR4有潜在的相关性，笔者将在大鼠肠上皮细胞上考察miR-142-3p对HMGB1-TLR4靶基因的作用。炎症基因NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α均为HMGB1-TLR4的靶基因。使用LPS刺激后，施加miR-142-3p大大抑制了NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表达，这表明miR-142-3p具有抗炎作用（图1）。
二、HMGB1是miR-142-3p的靶基因
TargetScan预测软件分析表明miR-142-3p在HMGB1的3′UTR上有潜在的结合位点（CACUAC），表明miR-142-3p很有可能调控HMGB1的表达（图2A）。此外，此结合位点在不同种属之间有良好的保守性。miR-142-3p可抑制HMGB1 3′UTR活性，miR-142-3p浓度越高，HMGB1 3′UTR活性越低（F = 10.86，P < 0.05，其中miR-142-3p浓度为50 nmol vs. 25 nmol，P = 0.0102 ;miR-142-3p浓度100 nmol vs. 25 nmol，P = 0.0001）（图2B）。然而当结合位点突变为ACGCGA，miR-142-3p不再调控HMGB1 3′UTR的活性，这表明miR-142-3p调控HMGB1依赖结合位点CACUAC（图2C）。
三、miR-142-3p的抗炎作用依赖于HMGB1
讨论
IBS是一种以复发性腹部不适或疼痛为特征的临床综合征[5-6]。在全球范围内，IBS在男性中的发病率为4%，在女性中为14%，且发病年龄多集中于青壮年，并具有慢性、易复发性等特点，已成为严重影响人们生活质量的主要疾患之一[5-6]。临床研究显示，急性胃肠道感染与IBS发病关系密切，3%~36%的急性肠道感染患者最终会发展为IBS[7]。这种在感染性胃肠炎发生后形成的IBS又称PI-IBS， 是IBS的重要类型和研究热点[4]。PI-IBS的发病机制目前尚不十分明确，有研究认为细胞因子失衡、肠道菌群失调，特别是肠道免疫应答的异常激活是导致PI-IBS发生的关键因素[2⇓-4]。笔者团队既往研究发现PI-IBS患者体内抗炎和促炎细胞因子表达水平存在失衡，其导致低度炎症和免疫激活最终导致了疾病的发生。通过恢复PI-IBS患者体内细胞因子的稳态，可以有效预防和缓解PI-IBS的症状。由于免疫细胞因子和应答网络的复杂性，因此发掘更多调节PI-IBS肠道炎症反应的关键调控因子，对于阐明PI-IBS发病机制和开发新型治疗方法至关重要。
miR是一类内源性非编码小RNA，广泛参与调控细胞的多种生理过程，其异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。得益于核酸药物和靶向递送理论和转化研究的迅猛发展，目前已有靶向miR的药物进入到临床研究。miR-142-3p是一种在结直肠等多种组织器官中高表达的miR，对炎症反应具有重要的调控作用。Zhai等[8]研究发现，miR-142-3p通过靶向自噬基因ATG16L1缓解炎症反应。笔者对miRNA靶基因测序数据进行分析发现，表达差异明显的miR-142-3可能可以作为PI-IBS的生物学标志物。HMGB1是一种重要的晚期致炎因子，参与多种组织和细胞的炎症反应和免疫应答。HMGB1可通过与TLR家族受体结合，激活下游信号通路（如核因子κB）和炎症小体（如NLRP3），促进细胞因子的合成和释放，调控免疫应答反应，并参与多种炎症相关疾病的发生[9-10]。HMGB1是一种炎症性蛋白，其广泛分布于各种组织中，并可通过与多种受体结合促进下游信号转导通路的激活，参与炎症性疾病的发生发展。TLR是HMGB1的重要受体，参与多种感染和机体损伤机制。HMGB1可以和TLR4、TLR2受体结合，引起核因子κB信号转导通路上调，促进炎性细胞因子释放，进而引发炎症反应[11-12]。有研究显示，HMGB1在NSAID诱导的PI-IBS中起到重要作用。使用NSAID诱导PI-IBS后，大鼠肠道和血清中的HMGB1表达提高，施加人重组HMGB1蛋白会加重NSAID诱导的肠道损伤，激活核因子κB信号转导通路，促进肠道TNF-α等促炎因子的表达，并同时降低抗炎因子IL-10的水平，而HMGB1抗体则能部分阻断NSAID诱导的肠道损伤[13]。另外，敲除HMGB1的TLR4后，明显缓解HMGB1的加重肠道损伤，证明HMGB1-TLR4信号通路在调控NSAID诱导的PI-IBS中发挥重要作用[13]。
笔者团队前期收集PI-IBS患者及健康人群的样品各10例进行qRT-PCR实验，检测miR-142-3p、HMGB1和 TLR4的表达情况，发现与正常人群相比，PI-IBS患者中miR-142-3p水平明显下调，而HMGB1和TLR4的mRNA水平明显上调。这说明miR-142-3p可能与HMGB1-TLR4有潜在的相关性。之后在大鼠肠上皮细胞中进一步发现miR-142-3p可降低HMGB1-TLR4-核因子κB的靶炎症基因如NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表达，并且此抗炎作用依赖于HMGB1。这提示miR-142-3p对HMGB1的调节可能与PI-IBS的发生密切相关。进一步的软件预测结果表明miR-142-3p可以与HMGB1的3′-UTR直接结合。基于以上证据，笔者团队预测 miR-142-3p可能通过抑制晚期促炎因子HMGB1的表达，下调TLR4-NF-κB/NLRP3信号转导通路，从而减轻肠道黏膜的炎症反应和免疫应答，最终防止PI-IBS的发生发展。后续笔者将在动物实验中系统解析miR-142-3p在PI-IBS发生发展中的关键作用，并对其下游炎症反应激活信号转导通路进行探索和验证，以揭示并阐明miR-142-3p调控PI-IBS发生发展的分子机制，为PI-IBS的临床治疗提供理论依据和治疗手段。