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文章视频简介
血管钙化是慢性尿毒症患者发病和死亡的高危因素[1]。组织学上，血管钙化分为2种类型，一种是与动脉粥样硬化相关的内膜钙化，表现为富含脂质的巨噬细胞浸润的内膜增生;另一种是中膜钙化，钙磷酸盐沉积于动脉中膜的平滑肌层，主要见于代谢相关疾病，如慢性尿毒症和糖尿病[2-3]。多项研究表明在慢性肾脏病患者中，高钙血症、甲状旁腺激素水平升高、炎症细胞因子、氧化应激、高磷血症等因素参与血管钙化[4⇓⇓⇓-8]。近年研究表明，血管钙化是主动的、细胞介导调控的生物学进程，与软骨和骨形成类似，表现为血管平滑肌细胞伴随骨形成相关蛋白[Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨形态发生蛋白（BMP2）]的上调表达[9-10]。转录因子D位点结合蛋白（DBP）属于脯氨酸和酸性氨基酸含量丰富的碱性亮氨酸拉链（PAR bZIP）转录因子家族成员，可结合靶基因启动子区特异的序列并激活转录调控生物昼夜节律[11]。DBP是否参与尿毒症的调控尚未阐明，因此本研究对尿毒症血管钙化模型大鼠尾静脉注射小干扰DBP（shDBP）慢病毒，研究DBP在抑制尿毒症血管钙化模型的作用及潜在机制。
材料与方法
一、材 料
1. 实验动物
24只清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠，8周龄，体质量180~220 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物的使用和处理过程均符合动物实验相关伦理规范。
2. 主要试剂和仪器
限制性内切酶AgeI、EcoRI购于纽英伦生物技术（北京）有限公司;RUNX2、β-actin抗体购于美国CST中国公司。德国Eppendor 5920 R高速低温离心机，中国粤显XJL-20/XJL-20BD普通光学显微镜，美国Thermo HR1500-II生物安全柜，美国伯乐小型水平电泳槽，海尔HCB-1300V超净工作台。
3. 短发夹RNA（shRNA）设计和构建
参照已知GenBank所示DBP mRNA序列以及shRNA的设计要求， 设计并合成靶向DBP的特异性shRNA（shDBP）序列：正向5′-CCGGGAAGCCTCAGCCAATCATGAACTCGAGTTCATGATTGGCTGAGGCTTC-3′， 反向5′-AATTCAAAAAGAAGCCTCA
GCCAATCATGAACTCGAGTTCATGATTGGCTGAGGCTT-3′， 同时设计相应的阴性对照shRNA（shNC）序列： 正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。 shDBP和shNC序列由广州辉园苑医药科技有限公司设计、 合成， 并重组到pLKOG-shRNA质粒， 对应质粒的名称为pLKOG-shDBP和pLKOG-shNC。
GCCAATCATGAACTCGAGTTCATGATTGGCTGAGGCTT-3′， 同时设计相应的阴性对照shRNA（shNC）序列： 正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。 shDBP和shNC序列由广州辉园苑医药科技有限公司设计、 合成， 并重组到pLKOG-shRNA质粒， 对应质粒的名称为pLKOG-shDBP和pLKOG-shNC。
二、方法
1. shDBP和shNC慢病毒包装及病毒滴度检测
将处于对数生长期的293T细胞接种到细胞培养皿，待细胞密度达到约80%时将pLKOG-shDBP和pLKOG-shNC分别与慢病毒包装质粒共转染到293T细胞， 分别在24、48 h转染换液时收集细胞培养上清，通过低温超速离心浓缩假病毒颗粒，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬的慢病毒浓缩液根据Lentivirus Titration Kit（TaKaRa）操作手册检测病毒滴度。
2. 模型制备
选取24只雄性SD大鼠按数字表法分为4组，每组各6只。根据参考文献[12]采用两步法切除肾脏：选取18只大鼠予5%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，切除大鼠2/3左肾，并于4 d后全切除大鼠右肾，术后1周存活的大鼠喂饲高磷饲料（含0.9%钙、1.2%磷，购于江西协同生物工程有限责任公司）诱导血管钙化模型[13]。模型组：慢性尿毒症血管钙化模型大鼠喂饲高磷饲料8周后，予尾静脉注射生理盐水4周。慢病毒对照组（shNC组）：慢性尿毒症血管钙化模型大鼠喂饲高磷饲料8周后，予尾静脉注射对照慢病毒4周。抑制DBP慢病毒组（shDBP组）：慢性尿毒症血管钙化模型大鼠喂饲高磷饲料8周后，给予抑制DBP慢病毒尾静脉注射4周。余下喂饲标准饲料的6只大鼠为空白组。治疗4周后，测量4组大鼠的体质量，并收集4组大鼠的颈静脉血、尿液、胸主动脉组织样本用于后续的指标检测，每个指标检测至少3个生物学重复。
3. 生化指标检测
取大鼠颈静脉血离心分离血清，采用山东博科生物产业有限公司全自动生化分析仪及配套试剂检测其血清肌酐、血钙、血磷及尿液尿素氮水平。
4. 大鼠胸主动脉血管组织DBP和RUNX2的mRNA表达检测
采用逆转录-实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测。根据RNA提取试剂盒说明书提取4组大鼠胸主动脉血管组织总RNA，逆转录为模板DNA，进行RT-qPCR检测。所需引物由广州艾基生物技术有限公司合成（表1），以β-actin为内参对照，采用2-ΔΔCt法分析DBP和RUNX2的mRNA表达水平。
表1 RT-qPCR检测各基因引物序列 |
| 基 因 | 正向（5′→3′） | 反向（5′→3′） | 产物长度/ bp |
|---|---|---|---|
| DBP | AAACAGCAAGCCCAAAGAACC | GCGTCCAGGTCCACGTATTC | 192 |
| RUNX2 | CGGACGAGGCAAGAGTTTCA | GGATGAGGAATGCGCCCTAA | 192 |
| β-actin | AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCT | AGCTCAGTAACAGTCCGCCT | 171 |
5.大鼠胸主动脉血管组织RUNX2蛋白表达检测
用RIPA裂解液处理4组大鼠的胸主动脉血管组织，蛋白定量后取10 μg总蛋白进行电泳分离并转移至PVDF膜。加入RUNX2抗体（1∶1000）、β-actin抗体（1∶1000）于4 ℃过夜孵育，用Image J软件分析条带的灰度值。
6. 大鼠胸主动脉血管组织病理学检测
免疫组织化学（免疫组化）染色：取4组大鼠的胸主动脉血管组织制作石蜡切片后行抗原修复，加入增殖细胞核抗原（PCNA） 抗体（1∶1000）于4 ℃孵育过夜，37 ℃孵育二抗2 h，3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色。HE染色：取4组大鼠的胸主动脉血管组织制作石蜡切片后行HE染色，光镜下观察血管病理学变化。
7. 数据来源及预处理
本研究所用的测序数据来源于基因表达综合数据库（GEO）。慢性尿毒症大鼠的主动脉血管平滑肌mRNA表达数据来源于GSE146638[14]。对所筛选的慢性尿毒症大鼠（慢性尿毒症组）与对照组大鼠主动脉血管平滑肌中差异表达的基因，分别进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。
三、统计学处理
采用SPSS 22.0分析数据。正态分布的计量数据以 表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。非正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，组间比较采用Wilcoxon符号秩检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、GEO分析结果
选取数据集GSE146638中的5只慢性尿毒症大鼠（慢性尿毒症组）和5只正常对照大鼠（对照组）的主动脉血管平滑肌组织mRNA表达数据， 结果显示有86个基因上调、335个基因下调，差异表达基因主要富集在MAPK信号通路和PI3K/AKT信号通路。根据分析结果，选取差异表达基因糖转运蛋白基因SLC22A2、转录激活因子3（ATF3）、DBP、鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）为候选基因。RT-qPCR法检测结果分析显示，与对照组相比，慢性尿毒症组的血清DBP和SMPD3 mRNA相对表达量上调（P均< 0.05）。见表2。
表2 GEO中慢性尿毒症组与对照组大鼠血清中差异表达基因mRNA相对表达量比较 |
| 组 别 | n | SLC22A2 | ATF3 | DBP | SMPD3 |
|---|---|---|---|---|---|
| 慢性尿毒症组 | 5 | 0.99±0.45 | 0.33（0.17，1.24） | 10.90（1.56，20.24） | 5.05（0.80，9.25） |
| 对照组 | 5 | 1.00±0.42 | 0.57（0.41，1.25） | 1.00（0.19，1.81） | 1.00（0.07，1.10） |
| t/Z值 | 0.045 | 1.663 | 2.365 | 2.455 | |
| P值 | 0.964 | 0.096 | 0.018 | 0.014 |
二、4组大鼠的一般状态及生化指标比较
喂饲高磷饲料8周并干预治疗4周后，与空白组比较，模型组、shNC组和shDBP组大鼠的体质量较低、血清肌酐水平较高（P均< 0.05）。其中shDBP组大鼠体质量比基线轻微增加，shNC组、shDBP组血清肌酐水平均低于模型组，但比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）;4组的血钙、血磷和尿液尿素氮水平比较差异亦无统计学意义（P均> 0.05）。见图1。
三、4组大鼠的胸主动脉血管病理检查结果比较
喂饲高磷饲料8周并干预治疗4周后，HE染色结果显示，模型组和shNC组胸主动脉壁中膜厚度增厚，shDBP组的增厚程度较模型组减轻;免疫组化检测结果显示模型组和shNC组胸主动脉PCNA表达上调，shDBP组较模型组PCNA表达减弱。见图2。
四、4组大鼠的胸主动脉血管DBP及RUNX2表达情况比较
RT-qPCR结果显示，与空白组相比，模型组DBP mRNA表达水平上调（P < 0.05）;与模型组相比，shNC组、shDBP组胸主动脉血管中DBP mRNA表达均下调（P均< 0.05），提示靶向DBP的干扰RNA能够抑制靶基因表达。RUNX2 mRNA表达水平显示，与空白组相比，模型组、shNC组RUNX2 mRNA表达上调，其中shNC组RUNX2表达与空白组比较差异有统计学意义（P < 0.05），shDBP组RUNX2 mRNA表达下调（P < 0.05）;RUNX2蛋白表达丰度也观察到相似的结果。见图3。
讨论
本研究予慢性尿毒症大鼠喂饲特殊配方饲料，以高磷饲料诱导血管钙化模型，经GEO数据集分析发现DBP在慢性尿毒症组血管组织中上调，构建了DBP慢病毒抑制表达载体，通过尾静脉将慢病毒注射到慢性尿毒症大鼠体内，并分析抑制DBP表达对慢性尿毒症大鼠血管钙化的影响及其机制。研究结果表明，抑制DBP表达可改善尿毒症大鼠血清肌酐水平，同时成骨相关蛋白RUNX2的蛋白和mRNA表达水平也受到抑制，这可能与DBP参与成骨相关蛋白RUNX2转录调控有关[19]。研究表明，血管钙化与软骨和骨形成类似，即通过上调骨形成相关蛋白表达。抑制DBP基因能下调尿毒症大鼠主动脉血管RUNX2表达，故能缓解尿毒症大鼠的血管钙化。
综上所述，抑制DBP基因可能通过抑制主动脉血管中的RUNX2 mRNA和蛋白表达，减轻慢性尿毒症大鼠血管钙化程度和尿毒症相关症状。本研究为利用抑制DBP基因修饰减轻慢性尿毒症相关症状和血管钙化提供了理论依据。