肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。根据2020年全球癌症统计数据显示，原发性肝癌在全球范围内的新增病例约90.6万，死亡病例约83万[1]。据2022年最新统计，在中国肝癌的发病率和病死率分别占据第四位和第二位[2]。代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是肝癌发生的重要危险因素，其发病率和流行率呈上升趋势，很可能超过病毒因素成为全球肝细胞癌（HCC）患者发病的主要原因[3]。虽然手术治疗、化学治疗、局部消融、分子靶向治疗等治疗手段显著提高，但由于早期症状隐蔽、发展快、侵袭强，肝癌患者平均生存时间仍然很短[4]。因此，迫切需要深入了解肝癌发生发展的分子机制，以提高临床的治疗效果。
中性粒细胞是先天免疫系统的关键参与者。中性粒细胞通过吞噬、脱颗粒、产生活性氧（ROS）和中性粒细胞胞外诱捕网（NET）等不同机制来捕获或降解入侵的病原体[5]。然而，中性粒细胞可以增强循环肿瘤细胞的黏附性，通过分泌细胞因子和释放NET，促进肿瘤的生长和转移[5]。Brinkmann等（2004年）首次报道了IL-8、佛波酯或脂多糖刺激中性粒细胞后形成NET。NET是由解聚的染色质和颗粒蛋白组成的网状结构，具有捕获和杀死病原微生物的作用[6]。NET的形成被描述为一种独特的程序性细胞死亡方式，这一过程被称为中性粒细胞炎性凋亡（NETosis）[7]。据报道，NET在肿瘤生长、转移及癌症相关血栓形成中发挥着重要的作用[8]。因此，本研究首先阐述了NET的形成机制。其次，探讨了NET在肝癌生长、侵袭、转移以及癌症相关血栓形成中的作用。笔者将根据最新的发现总结NET在肝癌中的研究进展，为抗肿瘤治疗提供新的思路和方法。NET作为抗肿瘤治疗的潜在靶点，在未来研究中具有广阔的前景。
一、 NET的概述
1. NET结构和形成
Takei等（1996年）首次报道了NET。NET主要是核DNA和颗粒蛋白组成的网状结构，该结构上装饰有中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）、组织蛋白酶G（CG）、白细胞蛋白酶3、乳转铁蛋白（LTF）等。高分辨扫描电子显微镜显示，NET由直径为15~17 nm的纤维和25~50 nm聚集复合体的球形结构组成。迄今为止，多项研究已经揭示了NET形成的不同途径。在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖或补体因子5a（C5a）刺激后，中性粒细胞以ROS依赖的方式释放线粒体DNA产生NET，NET的产生促进了肿瘤进展的转移前生态位[9]。在金黄色葡萄球菌和佛波酯的刺激下，中性粒细胞核小叶形态消失，核膜破裂，去浓缩的染色质与细胞质和颗粒成分混合，内膜丧失导致细胞器消失，随后释放NET到细胞外空间，它的形成依赖于NADPH氧化酶（NOX）产生的ROS[10]。在NETosis形成过程中还涉及不同的受体，如Toll样受体（TLR）、NOD样受体、补体受体和趋化因子受体等[11]。
2. NET形成的机制
2. 1 NOX依赖性NETosis
NET的形成过程始于病原体和多种物质的刺激，如佛波酯、抗体、胆固醇晶体、脂多糖、IL类等，这些外来刺激激活中性粒细胞表面的特异性受体，细胞表面受体的激活导致蛋白激酶C（PKC）/Raf/MEK/ERK激酶信号通路的活化和gp91phox磷酸化，促进细胞内钙离子增加，从而激活NOX的活性，随后产生ROS[12]。ROS的产生触发NE和MPO解离。NE从膜相关复合物解离进入胞浆，并依赖于MPO激活其蛋白水解活性。在细胞质中，NE可结合并降解F肌动蛋白，然后再从嗜天青颗粒转移至细胞核。在那里NE可降解部分核小体组蛋白，促进DNA浓缩。随后，MPO消耗过氧化氢（H2O2）生成次氯酸，协同增强染色质解聚。解聚的染色质进入胞质， GSDMD诱导质膜破裂，驱动染色质排出细胞外空间，导致中性粒细胞死亡，释放出NET。此外，在这个过程中，肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）也被激活，在中性粒细胞中PAD4高表达，催化组蛋白精氨酸残基转化为瓜氨酸，导致染色质去浓缩，核肿胀，核膜和质膜通透性增加，核层粘连蛋白形成网状结构，核膜和质膜破裂并释放细胞外DNA[13-14]。这个过程也称为NOX依赖性NETosis。
2. 2 NOX非依赖性NETosis
中性粒细胞在金黄色葡萄球菌、革兰阳性杆菌等刺激下，迅速释放NET，这一过程中性粒细胞经历了明显的形态变化，表现为多叶细胞核变圆并浓缩，内、外核膜分离，囊泡出芽，囊泡内充满核DNA，然后将DNA释放到细胞外空间。整个过程是一种独特的、快速的，不依赖于NOX的途径。重要的是，在NET释放后，中性粒细胞质膜未破裂，且无核中性粒细胞仍然存活并保持迁移和吞噬能力。此外，在微生物、钙离子载体A23187和离子霉素等刺激下，中性粒细胞表面特异性受体（TLR4、TLR2受体和补体受体3）被激活，与配体结合触发内质网中钙的释放，导致细胞内钙浓度增加，然后打开质膜钙通道，触发了中性粒细胞中线粒体ROS的产生，并激活了小电导钙激活钾离子（SK）通道和PAD4[10]。PAD4是一种瓜氨酸蛋白酶，它被激活后转移至细胞核，在那里PAD4将精氨酸转化为瓜氨酸，瓜氨酸化的组蛋白所带正电荷减少，降低了组蛋白与带负电荷DNA之间的亲和力，组蛋白从DNA中解离，导致紧密的染色质结构丧失，最后染色质解聚[15]。这被认为是形成NOX非依赖性NETosis所必需的。此外，中性粒细胞用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子与脂多糖或C5a联合刺激时，NETosis的形成依赖于线粒体以ROS的方式释放DNA。使用ROS抑制剂二苯基氯化碘盐时，发现在相同条件下中性粒细胞线粒体DNA释放完全阻断。因此，形成这种NET的释放被认为是线粒体NET或者NOX非依赖性NETosis[16]。
二、 NET与肝癌
NASH是发展为肝癌的重要危险因素。据报道，NASH患者血清中NET标志物水平明显升高。van der Windt等（2018年）研究显示，在STAM小鼠模型中，肝脏中可见大量中性粒细胞浸润和NET的形成，NET的释放导致炎性细胞因子产生和肝癌进展。然而，脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）减少了STAM小鼠中浸润性巨噬细胞和炎症因子的产生，抑制NASH向肝癌进展。此外，在NASH相关的HCC（NASH-HCC）中，NET与幼稚的CD4+T细胞表面TLR4受体相互作用，启动代谢重编程，调节性T细胞（Tr）分化，重塑免疫抑制微环境，促进NASH-HCC的发生和发展。然而，在体内使用PAD4-/-小鼠或DNase I可阻断NET的形成，降低Tr细胞的活性，预防NASH-HCC[17]。
肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的主要原因。Yang等[18]在肝癌患者血清和肿瘤组织中观察到NET标志物MPO-DNA水平明显高于健康对照组。MPO-DNA是癌症患者无复发生存期和总体生存期的独立预测标志物[19]。最近相关研究报道，在肝癌患者中，中性粒细胞以线粒体ROS依赖的方式形成富含线粒体DNA的NET，这些NET可触发肿瘤炎症反应，促进肿瘤细胞侵袭和转移[20]。然而，NET对肝癌增殖、侵袭和转移以及癌症相关血栓的形成中的具体机制知之甚少。Tohme等（2016年）报道，肿瘤细胞可以诱导中性粒细胞释放NET促进手术应激后肝脏转移的发生和发展。NET的主要成分DNA（NET-DNA）与肿瘤转移有关。NET-DNA可能作为一种趋化因子来吸引肿瘤细胞导致远处转移。跨膜蛋白CCDC25是肿瘤细胞上的一种NET-DNA受体，可感知胞外DNA，随后激活ILK-β-parvin-RAC1-CDC42级联反应，促进肿瘤细胞黏附、增殖和迁移。敲除CCDC25基因显著抑制了NET对肿瘤细胞的黏附、迁移和细胞骨架重塑。使用DNase Ι处理荷瘤小鼠，防止了NET的形成和肝转移的发生[21]。在小鼠肝脏缺血/再灌注（I/R）模型中，血小板TLR4以ERK5/整合素GP Ⅱb/Ⅲ a依赖的方式诱导血小板活化和血小板-肿瘤细胞聚集体的形成，促进NET捕获循环中的肿瘤细胞和手术应激后的远处转移。敲除TLR4可以使小鼠免受肝脏I/R模型中NET诱导的转移潜能[22]。在盲肠穿刺不结扎的裸鼠模型中，中性粒细胞释放的NET激活了TGF-β信号通路，促进肿瘤细胞外渗，并植入肝脏和腹膜中，诱导肿瘤细胞增殖和转移。使用TGF-β通路抑制剂LY2157299可明显抑制肝脏和腹膜转移[23]。在体外，肿瘤浸润性中性粒细胞通过糖酵解和磷酸戊糖途径激活NOX-ROS信号通路触发NET的形成，NET诱导HepG2肿瘤细胞上皮-间充质转化，促进肿瘤细胞侵袭和迁移[24]。此外，肝癌细胞来源的CXCL8/IL-8以NADPH依赖的方式触发中性粒细胞释放NET，与NET相关的CG下调了E-钙黏蛋白的表达，增加体外炎症因子水平，促进肿瘤细胞的侵袭。阻断PAD4或抑制CG，减少了NET的形成，削弱了肝癌细胞的侵袭和转移能力[25]。
三、结论
最初NET被认为是一种捕获和杀死病原微生物的防御系统。然而，近年来相关研究表明，NET在多种恶性肿瘤进展中发挥重要作用。本文主要阐述了NET的形成机制以及其在肝癌中的作用，如上所述，某些外来刺激或细胞因子触发NET的形成，NET可以通过激活下游信号通路促进肿瘤发生发展。另外，NET可以充当血栓支架，捕获和激活循环中的血小板，促进癌症相关血栓形成。靶向NET是一种有前途的抗肿瘤治疗策略。深入了解NET在肝癌发生发展中的机制，对抗肿瘤的治疗具有重大意义，为治疗方案的设计和新药物开发提供新思路。然而，目前关于NET在肝癌的生长、转移和癌症相关血栓形成的机制屈指可数，在未来需要更多的临床、体内及体外实验进一步研究NET与肝癌及其微环境的关系。