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内质网应激（ERS）是细胞应激的一种重要方式，内质网腔中未折叠或错误折叠的蛋白蓄积过多会导致ERS发生[1]。ERS参与了缺氧、肾缺血再灌注损伤（IRI）、肾毒性和炎症等引起的急性肾损伤（AKI）发病机制，这些病理状态均能诱导肾小管上皮细胞产生ERS，并诱导细胞凋亡[2-3]。衣霉素作为ERS的常用诱导剂，通过抑制N-糖基化并阻断N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶，引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累而诱导ERS[4-5]。人脐带间充质干细胞源外泌体（hUC-MSC-Exo）携带着蛋白分子、mRNA、微RNA及长链非编码RNA等作为细胞与细胞通信之间的联系[6]。研究表明，hUC-MSC-Exo通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（MAPK/ERK）信号通路的激活而抑制肾小管上皮细胞的凋亡[7]。MSC-Exo通过上调miR-146b的水平从而抑制NF-κB活性和减轻炎症反应，降低脓毒症相关的AKI小鼠的血清肌酐和血尿素氮水平，抑制了肾小管细胞凋亡[8]。尽管MSC-Exo显示出肾脏保护作用，但MSC-Exo对ERS状态下肾小管上皮细胞的作用机制尚未阐明。本研究旨在研究ERS状态下MSC-Exo对肾小管上皮细胞凋亡的调控，现报道如下。
材料与方法
一、材料
1. 试剂
衣霉素购自瑞士Enzo Life Sciences公司。DMEM购自美国Hyclone公司。胎牛血清、 抗体葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、GRP94、C/EBP同源蛋白（CHOP）、裂解的核糖聚合酶（c-PARP）、CD9、CD81、脂筏结构蛋白1（Flotin1）、 β-肌动蛋白（β-actin）、兔抗IgG、鼠抗IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司。流式抗体CD63、CD9、CD81购自Biolenged公司。二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司。基于Luminol 的增强化学发光（ECL）底物试剂蛋白显色液购自德国Advansta公司。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒购自美国Biolenged公司。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）细胞增殖检测试剂盒购自美国MedChem公司。Adamas life刃天青（resazurin）细胞活性检测染料购自上海泰坦科技股份有限公司。ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒购自美国SBI公司。
2. 细胞
人肾小管上皮细胞（HKC）细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供；hUC-MSC由福建省干细胞应用工程技术研究中心提供，取P3代细胞进行研究。
二、方法
1. 细胞培养
hUC-MSC培养于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素的低糖培养基中；肾小管上皮细胞HKC培养于10%胎牛血清的DF12培养基中，细胞均置于含体积分数为5%CO2、饱和湿度的37 ℃培养箱中。
2. 脐带间充质干细胞源外泌体的分离
按文献[9]方法操作：取P3代的hUC-MSC，无血清纯DMEM低糖培养基中培养48 h后收集上清，经3 000×g 15 min离心去除细胞碎片，按照ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒的说明书，将10 mL上清液与2 mL ExoQuick-TC试剂轻轻混合，于4℃过夜（至少12 h），在孵育期间离心管保持直立且不能摇动。经1 500×g离心30 min吸弃上清液，1 500×g离心5 min后，轻轻吸弃所有的液体，避免干扰到底部的外泌体沉淀。最后经100~500 μL无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬即可得到外泌体溶液。
3. 不同浓度衣霉素对细胞存活的影响
采用CCK-8法：HKC正常传代培养，胰酶消化后镜下计数细胞，5 000个/孔接种于96孔板，次日用含0.5%胎牛血清DMEM高糖培养基将衣霉素稀释成不同的浓度（0、1、2、4 μg/mL），每孔100 μL，培养24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，将培养板置于培养箱内温育2 h，将96孔板置于酶标仪上，测定450 nm处吸光度值，以对照组为100%，则细胞存活率=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。
4. 不同浓度外泌体对细胞增殖的影响
每孔5 000个HKC接种于96孔板中，次日加入不同浓度[0（Con）、40、60、80、100、150、200 μg/mL]外泌体或2 μg/mL衣霉素作用24 h后，按照上述CCK-8法测定450 nm吸光度。
5. resazurin法检测细胞增殖活性
每孔5 000个HKC接种于24孔板中，次日实验分组为对照组、衣霉素2 μg/mL组、衣霉素2 μg/mL +外泌体150 μg组，作用24 h后，每孔加入30 μL的resazurin溶液，在CO2培养箱中孵育4 h后，在590 nm处测定荧光强度。
6. 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达
各组收集的总蛋白用BCA法检测总蛋白浓度，随后取30 μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。室温下4%牛血清白蛋白BSA摇床上封闭1 h后，与1∶1 000稀释的一抗4 ℃孵育过夜。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-吐温20（TBST）洗膜3次，加入不同比例稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1 h，经TBST、PBS各洗膜3次后，加入ECL发光液孵育3 min后进行曝光显影。各蛋白表达量均以 β-actin为内参。
7. 流式荧光激活细胞分选术检测细胞凋亡
HKC经不同浓度衣霉素或与外泌体联合处理24 h，胰酶消化后收集细胞沉淀，经预冷的细胞染色液洗涤2次，加入试剂盒中的结合液重悬至细胞浓度为1×107/mL。每管吸取100 μL的细胞悬液，加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和10 μL碘化丙啶（PI）混匀后避光染色15 min。每管加入400 μL 结合液重悬后即上机检测。同时设置正常组细胞不染色调电压，经FITC Annexin Ⅴ和PI分别单染的细胞调补偿。
8. 流式细胞术检测外泌体表面标志物
将提取的40 μL外泌体与5 μL硫酸盐微珠室温共孵育15 min，加入5 μL 100 μmol/L的BSA溶液，室温孵育15 min。加入1 mL PBS孵育75 min，580×g离心5 min，弃上清液。将外泌体微珠（beads）的结合体中加入1 mL 100 mmol/L的甘氨酸溶液室温孵育30 min，经离心PBS洗涤2次后，重悬在350 μL PBS中，每管50 μL分装于流式管中，加入CD9、CD63、CD81的一抗（1∶200）避光孵育45 min，离心重悬后立即上机检测。
三、统计学处理
采用SPSS 16.0分析结果，CCK-8法检测细胞增殖活性，每个浓度5个复孔，取各浓度的平均值进行分析；荧光强度检测重复3次，每次3个复孔；流式细胞术分析3次重复实验的数据，取各次实验的均值为最后结果。连续变量以$\bar{x}±s$表示，多组间比较使用单因素方差分析，多重比较使用Dunnett-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、衣霉素诱导HKC细胞产生ERS并诱导凋亡
不同浓度衣霉素（0、1、2、4 μg/mL）作用HKC 24 h的细胞存活率总体比较差异有统计学意义（F = 26.650，P = 0.001），随后使用Dunnett-t检验显示，1、2、4 μg/mL衣霉素均能抑制细胞增殖（P均< 0.05），且细胞存活率随着衣霉素浓度增加呈下降趋势（图1A）。1、2、4 μg/mL衣霉素均能诱导ERS相关蛋白GRP78、GRP94和CHOP表达上调（图1B），2、4 μg/mL衣霉素诱导下的细胞凋亡早期标志物c-PARP蛋白表达增强（图1C）；流式细胞术显示，不同浓度衣霉素（0、1、2、4 μg/mL）作用HKC 24 h的细胞凋亡率总体比较差异有统计学意义（F = 59.960，P < 0.001），且1、2、4 μg/mL衣霉素作用下HKC凋亡加重（P均< 0.05），其中1、2、4 μg/mL衣霉素作用于HKC 24 h的细胞凋亡率分别为（6.32±0.23）%、（11.29±2.89）% 和（18.03±0.21）%（图1D）。
二、hUC-MSC外泌体的鉴定
蛋白免疫印迹分析显示，常氧及缺氧培养条件下hUC-MSC外泌体均共表达CD9、CD81和Flotin1这些外泌体的代表性标志物。流式细胞术检测进一步证实来源于hUC-MSC外泌体中CD9（59.2%）、CD63（73.4%）和CD81（63.5%）均呈阳性表达。见图2。
三、hUC-MSC-Exo对HKC细胞增殖和凋亡的影响
不同组别作用HKC 24 h的细胞增殖活性总体比较差异有统计学意义（F = 449.200，P < 0.001），随后使用Dunnett-t检验发现与对照组相比，加入40、60、80 μg/mL外泌体未明显促进HKC的细胞增殖活性，而加入100 μg/mL 外泌体处理的HKC细胞增殖活性为113.41%（P = 0.006）；经150 μg/mL和200 μg/mL 外泌体处理HKC细胞增殖活性分别为122.51%（P = 0.004）和141.68%（P = 0.001），见图3A。resazurin法检测细胞活性结果表明，衣霉素2 μg/mL组的荧光强度低于对照组（P = 0.002），而衣霉素2 μg/mL +外泌体150 μg组的荧光强度高于衣霉素组（P =0.012），见图3B、C。对照组、衣霉素2 μg/mL组、衣霉素2 μg/mL +外泌体150 μg组的细胞凋亡率分别为（0.18±0.01）%、（14.16±1.58）%、（8.18%±0.58）%，总体比较差异有统计学意义（F = 152.000，P < 0.001），对照组与衣霉素2 μg/mL组、衣霉素2 μg/mL组与衣霉素2 μg/mL +外泌体150 μg组比较差异均有统计学意义（P均< 0.05），见图3D。
讨论
MSC-Exo在治疗AKI中起重要作用，然而，MSC-Exo对ERS诱导的肾小管上皮细胞凋亡的分子机制研究还很局限，因此研究MSC-Exo对ERS诱导的肾损伤的分子机制具有重要的现实意义。本研究中不同浓度的衣霉素（1、2、4 μg/mL）均能诱导HKC细胞产生ERS，相关的分子GRP78、GRP94和CHOP表达上调，并呈浓度依赖性；流式细胞术检测结果也表明ERS状态下能诱导HKC细胞凋亡。hUC-MSC-Exo处理组能明显增强细胞增殖活性；衣霉素诱导组细胞凋亡率为（14.16±1.58）%，而外泌体与衣霉素共处理组细胞凋亡率为（8.18±0.58）%，组间比较差异有统计学意义。笔者所在课题组的前期研究表明，hUC-MSC-Exo能通过携带的miR-21抑制ERS和p38 MAPK的磷酸化，从而减缓ERS并明显降低了胰岛内皮细胞的凋亡率[13]。本研究结果进一步表明，hUC-MSC-Exo能明显减缓衣霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡，从而在AKI中发挥保护作用。
已有研究发现，MSC-Exo可通过激活AKT和ERK信号通路，减轻髓核细胞ERS诱导的细胞凋亡[14]。Buono等[15]以衣霉素诱导角膜内皮细胞ERS为模型，MSC释放的细胞外囊泡（EV）能够诱导人角膜内皮细胞中ERS相关基因ATF4、GRP78、XBP1、CHOP显著下调，并抑制caspase-3蛋白的表达，其机制是通过MSC-EV中与ERS靶向性的微RNA分子，如miR-222-3p、miR-125b-5p、miR-21-5p转移至角膜内皮细胞而发挥潜在的治疗作用。Xie等[16]的研究表明MSC-Exo中miR-31-5p负调节ERS分子ATF6，通过miR-31-5p/ATF6/ER应激通路调节抑制椎体终板软骨细胞凋亡和钙化，这表明MSC-Exo在不同的ERS模型中均发挥一定的抗凋亡作用。本研究中，在ERS状态下，MSC-Exo可以减缓衣霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡，但外泌体发挥作用的信号通路及外泌体中的何种成分参与了ERS的调控将是我们下一步研究中要关注的重点。
综上所述，本研究表明hUC-MSC-Exo能明显抑制ERS状态下肾小管上皮细胞凋亡。