乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在我国乳腺癌的发病率增长迅速，在女性原发肿瘤中所占比例高达15%，且呈明显年轻化趋势[1]。三阴型乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌的特殊亚型，具有发病年龄偏小、分化程度低、侵袭性高、复发率高等特点[2]。雷帕霉素（Rapa）已经被研究证实是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的别构抑制剂，可以通过抑制mTOR的活性，对肿瘤、代谢类疾病以及神经退行性疾病产生影响[3⇓-5]。肿瘤坏死因子相关蛋白1（TRAP1）是热休克蛋白90 （HSP90）伴侣家族的成员，主要存在于线粒体中。已有文献报道，mTOR对于线粒体的活性起到了重要调节作用，而TRAP1作为线粒体呼吸的负调控因子，能够影响肿瘤细胞的呼吸方式[6-7]。TRAP1被广泛认为是抗癌分子靶点，雷帕霉素作为mTOR的别构抑制剂可能通过TRAP1发挥药理作用，目前尚没有研究提及两者之间的关系。本研究旨在探讨雷帕霉素调控TRAP1影响乳腺癌细胞MDA-MB-231代谢功能的分子机制，从代谢角度探讨雷帕霉素影响乳腺癌细胞增殖的作用，丰富雷帕霉素抗肿瘤的作用机制。
材料与方法
一、材料
胎牛血清，苏州依科赛生物科技股份有限公司；DMEM，美国Gibco公司；雷帕霉素，MCE公司；mTOR、p-mTOR抗体，CST公司；TRAP1抗体，美国Affinity公司；ATP检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司；乳酸测试盒，南京建成生物工程研究所。
二、细胞培养和分组
人三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231（HTB-26）购自美国ATCC细胞库。细胞培养基由10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和DMEM构成。将细胞接种在孔板中，24 h细胞贴壁后，将雷帕霉素加入细胞。设置100 nmol/L、500 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 的浓度梯度检测雷帕霉素对乳腺癌细胞增殖的影响。同时测定雷帕霉素的半抑制浓度（IC50），并以IC50为雷帕霉素组研究条件，正常细胞作为对照组，进一步研究雷帕霉素对MDA-MB-231细胞周期和能量代谢的影响。
三、方法
1.四氮唑蓝（MTT）比色实验
取对数生长期的MDA-MB-231接种于96孔板中，种板后24 h使用不同剂量的雷帕霉素处理细胞，加入MTT，检测各组在490 nm处的吸光度，计算药物对细胞的抑制率。药物对细胞的抑制率计算=1-（实验-空白）/（阴性-空白）×100%。
2. 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达
取对数生长期的MDA-MB-231接种于灭菌培养皿中，24 h加药，48 h提取总蛋白。用8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白；300 mA、3 h转膜至NC膜上，用5%脱脂牛奶封闭，加入一抗于4 ℃过夜；次日加入二抗孵育，洗膜成像。
3. 定量PCR（q-PCR）检测基因表达
取对数生长期的MDA-MB-231接种于灭菌培养皿中，24 h后加药，加药后48 h提取RNA，逆转录后上机检测，约2 h后收取样本，分析结果。
4. 细胞周期检测
取对数生长期的MDA-MB-231接种于灭菌培养皿中，24 h后加药，48 h消化离心后用70%乙醇溶液固定。隔日离心弃上清，用PBS清洗后将PI染色液加入细胞中，上机检测。
5. ATP检测试剂盒检测ATP含量
取对数生长期的MDA-MB-231接种于灭菌培养皿中，24 h后加药，加入ATP裂解液，多功能酶标仪检测化学发光值。运用BCA检测法得出蛋白浓度，可计算出每毫克蛋白所拥有的ATP含量，即ATP浓度（nmol/mg）=测得ATP浓度/蛋白浓度。
6. 乳酸检测试剂盒检测乳酸含量
取对数生长期的MDA-MB-231接种于灭菌培养皿中，24 h后加药，48 h后取上清，使用多功能酶标仪测得波长为530 nm时的吸光度，计算样本中乳酸的含量。上清中乳酸的含量（mmoL/L）=（样本-空白）/（标准-空白）×3×4。
四、统计学处理
采用SPSS 25.0统计分析软件，用$\bar{x}±s$进行统计描述，不同剂量给药组的生长抑制率采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05时差异有统计学意义。
结果
一、雷帕霉素对MDA-MB-231增殖的影响
MTT比色实验结果显示，经过不同剂量的雷帕霉素处理后，24 h、48 h的细胞增殖活性均有所下降（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001），雷帕霉素对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用呈时间依赖和剂量依赖趋势，见图1。雷帕霉素处理细胞48 h的IC50约为10 μmoL/L，因此本研究选用10 μmoL/L、48 h为处理条件，进行下一步的研究。
二、雷帕霉素对MDA-MB-231中mTOR的抑制作用
使用雷帕霉素10 μmoL/L处理细胞，48 h后提取RNA以及蛋白并进行检测。结果显示，雷帕霉素组mTOR的mRNA变化差异无统计学意义（P > 0.05），mTOR磷酸化水平降低（P < 0.001），但总蛋白的变化差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。
三、雷帕霉素对MDA-MB-231中TRAP1表达的影响
使用雷帕霉素10 μmoL/L处理细胞，48 h后提取RNA以及蛋白进行检测。结果显示，与对照组相比，雷帕霉素组TRAP1的基因以及蛋白水平均下降（P < 0.05，P < 0.001）。见图3。
四、雷帕霉素对MDA-MB-231细胞周期的影响
使用雷帕霉素10 μmoL/L处理细胞48 h，进行PI染色后用流式细胞仪检测，结果显示，对照组及雷帕霉素组G0/G1期的细胞百分率分别为（41.79±2.07）%和（47.3±1.3）%，S期的细胞百分率分别为（44.73±1.29）%和（42.42±2.3）%，G2/M期的细胞百分率分别为（13.48±1.78）%和（10.08±0.6）%。与对照组相比，雷帕霉素组细胞周期处于G0/G1期的细胞比例升高，且处于S期细胞和G2/M期的细胞比例减少（P < 0.05，P < 0.001），提示雷帕霉素可以阻止MDA-MB-231由G1期进入S期，造成G1期阻滞。见图4。
五、雷帕霉素对MDA-MB-231的ATP和乳酸的影响
讨论
肿瘤细胞生存和增殖离不开能量，糖酵解是肿瘤细胞能量代谢的主要方式[10]。给予雷帕霉素之后的MDA-MB-231生成的ATP上升、乳酸下降，因此推断雷帕霉素改变了MDA-MB-231的呼吸方式，使其更多地采用氧化磷酸化的呼吸方式进行供能。
TRAP1是HSP90的线粒体同源物，现已被证实在肿瘤细胞的线粒体内膜上广泛表达[11-12]。Zhang等[13]证实TRAP1的过度表达显著增加了它们对葡萄糖氧化酶的氧化应激的抵抗力，促进了Warburg效应，而敲除TRAP1能够下调线粒体有氧呼吸，使细胞对致命刺激敏感，并抑制肿瘤发生；Agorreta等[14]下调TRAP1发现其降低了细胞增殖和存活能力，诱导细胞凋亡，并损害了线粒体功能。本研究提示雷帕霉素能抑制TRAP1的表达，减缓线粒体功能的失调水平，肿瘤细胞的糖酵解水平被削弱。而ATP上升，乳酸下降，则抑制了MDA-MB-231的Warburg效应，促使乳腺癌细胞增殖水平下降[15⇓-17]。
综上所述，雷帕霉素可以通过抑制磷酸化mTOR的活化来降低TRAP1的表达，进而影响MDA-MB-231的ATP生成量和乳酸释放量，从而抑制乳腺癌细胞的有氧糖酵解，降低细胞的增殖活性，这为雷帕霉素治疗乳腺癌提供了新的理论依据。