肝细胞癌是原发性肝癌的主要类型，是全球癌症相关死亡的第三大常见原因[1-2]。肝癌的危险因素包括HBV感染相关肝硬化、各种致癌物、代谢性疾病和饮酒等众多病因。我国的HBV相关肝细胞癌患者约占肝癌病例的85%[3-4]。多数肝细胞癌患者发现即晚期，在有限的治疗选择下将面临1年生存率为15%~39%，总体5年生存率为10%~20%[5-6]。但是，早期诊断可以明显改善预后[7]。尽管超声、磁共振和甲胎蛋白已用于筛查和监测肝癌，但早期诊断率仍很低，因此，联合各种血清肝癌标志物早期诊断肝癌至关重要[8-9]。
甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）是由肝癌细胞产生的。AFP-L3水平与肝细胞癌的发展线性相关。脱-γ-羧基凝血酶原（DCP）是维生素K 缺乏或拮抗剂-Ⅱ诱导的蛋白质，可出现于肝细胞癌患者的血清中。近年来，血清肿瘤生物标志物如甲胎蛋白、DCP和甲胎蛋白异质体3比率（AFP-L3%），已逐渐用于肝癌的早期诊断[7,10 -11]。研究表明，甲胎蛋白对肝癌诊断的灵敏度和特异度较低，且不同病因相关肝癌的特异度和灵敏度大不相同[12⇓-14]。且目前很少有研究探讨多种血清肿瘤生物标志物联合在HBV相关肝细胞癌早期检测中的价值，尤其在我们国家HBV相关肝细胞癌占很大比例的情况下。因此，在本研究中，我们旨在探讨甲胎蛋白、AFP-L3%和DCP的不同组合在HBV相关肝癌患者早期诊断中的价值，提高患者肝癌早期诊断率。
对象与方法
一、 研究对象
选取2012年1月1日至2020年11月31日来自青岛市第六人民医院肝病病房或者门诊年龄35~55岁的肝细胞癌患者（肝细胞癌组）及HBV感染相关肝硬化患者（肝硬化组）。纳入标准：HBsAg阳性，HBeAg阳性或者HBeAg阴性的慢性HBV感染相关LC或肝细胞癌；ALT水平不超过正常上限值2倍，正常上限为40 U/L，HBV DNA小于2 000 IU/mL；腹部超声、磁共振和CT诊断明确肝硬化或肝细胞癌，或者肝穿病理明确诊断肝硬化或肝细胞癌。所有入选的患者肝功能分级（Child-Pugh评分系统）均为A级或B级，分期[巴塞罗那肝癌临床分期（BCLC分期）]均为最早期或者早期阶段患者（BCLC分期0期和A期），排除其他肿瘤或其他严重的基础疾病、转移性肝癌、吸毒、合并其他肝炎病毒感染、HIV感染和其他原因引起的肝硬化。本研究获得了研究对象的书面知情同意书，并经过青岛市第六人民医院伦理委员会许可（批号：PJ2023-06-29）。
二、 观察指标
检测研究对象的血清肿瘤生物标志物甲胎蛋白、DCP和AFP-L3%。抽取研究对象静脉血3~4 mL，3 500 r/min离心10 min分离血清备用。血清甲胎蛋白使用全自动化学发光酶免疫法（CLEIA）（型号LUMIPULSEG1200，日本富士瑞必欧公司）检测（甲胎蛋白检测试剂盒：上海一研生物科技有限公司）、DCP（ELISA 试剂盒：北京华健生物科技有限公司）、AFP-L3%采用磁微粒化学发光免疫分析双抗体夹心法检测（北京热景C2000分析仪）。所有步骤均按照说明书进行。
三、 统计学处理
采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料经 Kolmogorov-Smirnov检验进行数据正态性检验，符合正态分布计量资料以$\bar{x}±s$表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料以例（%）表示，比较采用χ 2检验，多组间比较采用方差分析。偏态分布计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）即M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Krushkal-Wallis H检验。为了评估和比较肿瘤生物标志物的诊断性能，绘制了每个肿瘤生物标志物单个及其组合受试者操作特征（ROC）曲线，根据曲线下面积（AUC）计算各肿瘤生物标志物单个及其组合的灵敏度、特异度和准确度。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、研究对象入组时的基线特征和临床特征
共167例患者入选本研究，其中肝细胞癌组100例，肝硬化组67例；肝细胞癌组中BCLC分期0期患者30例，BCLC分期A期患者70例。肝细胞癌组和肝硬化组患者的年龄、血红蛋白、肝功能（总胆红素、AST和ALT）、血小板、HBeAg阳性及HBeAg阴性比例、HBV DNA < 2 000 IU/mL及HBV DNA 2 000 IU/mL、HBsAg阳性及HBsAg阴性比例、BLCL分期比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。见表1。
表1 入组患者基线特征 |
| 项 目 | 肝硬化组（67例） | 肝细胞癌组（100例） | t/χ2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄/岁 | 47.28±7.99 | 49.34±16.97 | 0.925 | 0.356 |
| 血红蛋白/（g/L） | 67.28±8.31 | 69.20±6.58 | 1.657 | 0.099 |
| AST/（UI/L） | 34.49±19.94 | 42.46±15.18 | 1.238 | 0.219 |
| ALT/（UI/L） | 28.49±21.49 | 31.50±21.58 | 1.473 | 0.143 |
| 总胆红素/（μmol/L） | 22.17±15.59 | 19.95±16.82 | 0.863 | 0.389 |
| 血小板/（×109/L） | 146.21±96.52 | 141.97±64.57 | 0.292 | 0.771 |
| HBeAg阳性 | 48（71.64） | 68（68.00） | 0.616 | 0.732 |
| HBeAg阴性 | 19（28.35） | 32（32.00） | ||
| HBV DNA<2 000 IU/mL | 45（67.16） | 100（100.00） | 3.575 | 0.059 |
| HBV DNA>2 000 IU/mL | 22（32.84） | 0（0） | ||
| HBsAg（阳性） | 45（67.16） | 100（100.00） | 3.575 | 0.059 |
| HBsAg（阴性） | 22（32.84） | 0（0） | ||
| BLCL分期 | ||||
| 癌前病变 | 67（100.00） | 0（0） | ||
| 0期 | 0（0） | 30（30.00） | 0.651 | 0.618 |
| A期 | 0（0） | 70（70.00） |
二、 肝细胞癌组和肝硬化组甲胎蛋白、DCP和AFP-L3%水平比较
肝硬化组甲胎蛋白水平明显低于肝细胞癌组患者；肝细胞癌组AFP-L3%水平高于肝硬化组，且差异有统计学意义；肝细胞癌组DCP水平明显高于肝硬化组。见表2。
表2 肝细胞癌组和肝硬化组甲胎蛋白、DCP和AFP-L3%水平比较 |
| 项 目 | 分组 | 例数 | M（P25，P75） | Z值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 甲胎蛋白/（ng/mL） | 肝硬化组 | 67 | 3.00（2.00，6.00） | -4.462 | <0.001 |
| 肝细胞癌组 | 100 | 11.00（3.00，159.30） | |||
| AFP-L3%/% | 肝硬化组 | 67 | 1.00（1.00，2.00） | -3.358 | <0.001 |
| 肝细胞癌组 | 100 | 3.00（3.00，12.50） | |||
| DCP/（mAU/mL） | 肝硬化组 | 67 | 24.00（17.00，41.00） | -4.715 | <0.001 |
| 肝细胞癌组 | 100 | 66.50（24.25，358.80） |
肝硬化组甲胎蛋白水平低于肝细胞癌组0期和A期，组间比较差异有统计学意义；肝细胞癌组0期和A期比较甲胎蛋白水平差异无统计学意义（P > 0.05）；肝细胞癌组0期和A期AFP-L3%水平明显高于肝硬化组；肝细胞癌组0期和A期AFP-L3%水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）；肝细胞癌组A期DCP水平高于肝细胞癌组0期和肝硬化组，差异有统计学意义；肝细胞癌组0期和肝硬化组DCP水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。
表3 LC组与肝细胞癌组0期和A期的甲胎蛋白、DCP和AFP-L3%水平比较 |
| 组 别 | 例数 | 甲胎蛋白/（ng/mL） | AFP-L3%/% | DCP/（mAU/mL） |
|---|---|---|---|---|
| 肝硬化组 | 67 | 3.00（2.00，6.00） | 1.00（1.00，2.00） | 24.00（17.00，41.00） |
| 肝细胞癌0期 | 30 | 9.00（2.50，12.50） | 2.50（1.00，10.50） | 3.00（2.00，12.00） |
| 肝细胞癌A期 | 70 | 11.50（3.75，225.80） | 31.5（22.50，88.50） | 80.50（30.75，517.30） |
| H值 | 4.577 | 21.027 | 7.711 | |
| P值 | 0.017 | <0.001 | 0.009 |
注：使用独立样本Krushkal-Wallis H检验，组间检验通过Bonferroni校正法调整明显性值。 |
三、 甲胎蛋白、AFP-L3%和DCP在早期肝细胞癌的诊断性能
DCP在早期诊断肝细胞癌的灵敏度为60.0%，甲胎蛋白为51.5%。甲胎蛋白与DCP诊断肝细胞癌的AUC值差异无统计学意义（P > 0.05）。甲胎蛋白和DCP联合检测诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为67.0%和83.1%，其中AUC值最大。甲胎蛋白与DCP联合检测时，与甲胎蛋白单独检测相比，灵敏度由51.5%提高到67.0%，而特异度从92.5%仅下降到83.1%，甲胎蛋白+AFP-L3%联合检测的灵敏度53.5%，特异度89.1%，AUC值为0.761。甲胎蛋白、AFP-L3%和DCP联合检测的AUC值与甲胎蛋白和DCP联合检测的AUC值相同。见图1。
讨论
慢性HBV感染仍然是一个我国重要的公共卫生问题，HBV感染是我国肝细胞癌的主要原因[15]。肝癌患者预后差的主要原因是症状出现晚和晚期诊断，早期诊断是提高肝癌患者长期存活率的最重要因素。
本研究评估了甲胎蛋白、AFP-L3%和DCP诊断早期HBV相关肝细胞癌的诊断效能，结果显示甲胎蛋白和AFP-L3%的联合表现出与单独甲胎蛋白检测具有相似的诊断效能（AUC值分别为0.761和0.760）。然而，我们的结果与Helen等（2010年）报道不一致，这种明显的差异可能是因为本研究参与者是HBV相关的肝细胞癌和肝硬化，而把酒精性和丙型肝炎病毒等相关的肝细胞癌和肝硬化研究者已经被排除在外，而且我们入组的患者转氨酶水平2倍正常值以内，甲胎蛋白水平和转氨酶水平也具有相关性。
本研究表明甲胎蛋白诊断早期肝细胞癌表现出最好的诊断效能。因此，甲胎蛋白目前认为是最好的肝细胞癌监测肿瘤生物标志物，这和以前的研究报道一致[16]。DCP和甲胎蛋白诊断早期肝细胞癌的AUC值相似（分别为0.76和0.75）。DCP在临床研究中被广泛用于检测早期肝细胞癌，有研究报道DCP在早期诊断肝细胞癌方面比甲胎蛋白具有更高的灵敏度[17]。本研究结果显示DCP在早期诊断肝细胞癌的灵敏度为60.0%，甲胎蛋白在早期诊断肝细胞癌的灵敏度为51.5%，DCP的灵敏度高于甲胎蛋白，这和我们的研究结果相同；而且我们的研究结果还显示早期（A期）肝细胞癌患者血清DCP明显高于最早期（0期）肝细胞癌患者，而甲胎蛋白和AFP-L3%在早期（A期）肝细胞癌和最早期（0期）肝细胞癌血清无明显差异，提示DCP可能是诊断早期肝细胞癌良好的辅助肿瘤生物标志物，这和以前的研究报道相一致[18-19]。一项荟萃分析显示，DCP诊断HBV相关性肝细胞癌的灵敏度和特异度分别为0.71和0.93，这与本研究中DCP的诊断价值总体相一致[20]。Wu等（2014年）认为AFP-L3%是鉴别甲胎蛋白水平相对较低的肝细胞癌的有效生物标志物。本研究结果显示AFP-L3%在诊断早期肝细胞癌方面比甲胎蛋白和DCP具有更高的特异度，然而其灵敏度较低，可能限制其临床应用。另据报道，约30%~40%的早期肝癌患者血清甲胎蛋白水平正常，AFP-L3%显示出高的特异度也可以作为甲胎蛋白检测肝细胞癌的补充[21-22]。
甲胎蛋白和DCP联合检测可以大大提高诊断早期肝细胞癌的灵敏度，但特异度降低，这与以前研究结果相一致[23]。早期检测肝细胞癌的灵敏度增加是有益的，因为对于HBV相关肝细胞癌的监测，灵敏度可能比特异度更重要，延迟的肝细胞癌诊断，可能会导致肝细胞癌从早期阶段进展到晚期阶段，错失了治愈性治疗手段如手术切除或肝移植等，从而影响患者的生存期。我们也可以将血清肿瘤生物标志物联合无创的超声或CT等影响学检查，进一步提高肝细胞癌监测灵敏度，早期诊断从而及时治疗。
综上所述，甲胎蛋白目前仍然是诊断早期HBV相关肝细胞癌的最佳血清肿瘤生物标志物。甲胎蛋白和DCP联合可进一步提高早期HBV相关肝细胞癌的诊断效能，为早期诊断提供更多参考依据，具有较高的应用价值。