食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，该病被列为第七大最常见的癌症和第六大癌症死亡原因[1]。食管鳞状细胞癌（ESCC）是目前食管癌主要组织学类型，病死率在全球所有肿瘤中排名第四，总体5年生存率仅为15%~25%[2⇓-4]。由于大多数患者确诊时已处于中晚期，导致ESCC患者的预后不理想，5年总生存率较差[5⇓-7]。因此，探索ESCC发生转移的潜在机制，对ESCC早期诊断和治疗的新型生物标志物具有重要意义。
富含精氨酸和丝氨酸的卷曲螺旋1（RSRC1）也称SRrp53，编码富含精氨酸和丝氨酸家族的蛋白质，在细胞功能中发挥重要作用[8-9]。RSRC1被报道在胶质母细胞瘤、胃癌等癌症中低表达，发挥肿瘤抑制因子的作用[8,10]。如Teplyuk等[10]研究表明在胶质母细胞瘤中，RSRC1是微小RNA（miR）-10b的靶基因，miR-10b通过调节RSRC1的表达促进体内胶质母细胞瘤的恶性进展。RSRC1还被证明可以通过调节磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）表达来抑制胃癌细胞的增殖和迁移[10]。最近，一些研究表明 RSRC1基因多态性与癌症发病风险有关。如Tang等[11]发现RSRC1基因多态性与神经母细胞瘤易感性有关，该研究证实了携带RSRC1rs6441201A 等位基因的参与者与神经母细胞瘤风险增加密切相关 。目前关于RSRC1在肿瘤进展中的作用研究较少，且尚未有研究报道RSRC1在ESCC细胞发展中发挥的作用。因此，本研究将进一步探究RSRC1对ESCC细胞增殖和转移的影响及其作用机制。本研究拟探讨RSRC1在ESCC细胞增殖和转移中的作用，揭示RSRC1抑制ESCC细胞增殖和转移的新作用机制，现将结果报道如下。
材料与方法
一、生信分析
从TCGA数据库下载ESCC mRN表达矩阵 （normal：11，tumor：81），利用edgeR包进行差异分析。本研究所有实验设置3个重复。
1. 细胞培养及转染
人ESCC细胞系（TE-1，Eca-109，EC9706）和正常食管上皮细胞系Het-1A，培养在含10% FB的RPMI-1640（Corning，美国）中，于37 ℃和5% CO2的潮湿培养箱中培养。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）进行细胞转染，并根据试剂盒操作说明书将blank、NC和si-RSRC1转染到ESCC细胞。
2. qRT-PCR
通过TRIzol试剂 （Merck，德国） 从ESCC中提取总RNA。根据试剂盒说明，利用Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（Yeasen，中国）将总RNA反转录。使用 Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen，中国）在ABI 12K 荧光实时定量PCR（qRT-PCR） 仪（ThermoFisher，美国）上进行qRT-PCR。基于Eca-109细胞构建了以下细胞分组：blank组；NC组；si-RSRC1组，使用2-ΔΔCt方法计算相对RSRC1表达水平，并将GAPDH用作内源性对照。引物序列见表1。
表1 qRT-PCR引物 |
| 基 因 | 方向 | 引物序列 |
|---|---|---|
| RSRC1 | 正向 反向 | 5′-CAACATCAGGACCAGCATCAG-3′ 5′-GCCCATTAGTCTTTCTTGTCGG-3′ |
| GAPDH | 正向 反向 | 5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′ 5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′ |
3. 蛋白免疫印迹法
通过RIPAlysis buffer（Beyotime，中国）从培养的细胞中提取总蛋白质。使用BCA蛋白质测定试剂盒（Beyotime，中国） 检测蛋白质浓度。对于蛋白质印迹分析，细胞裂解物通过SDS-PAGE电泳，随后转移到 PVDF。然后将膜在室温下在脱脂牛奶中封闭约1 h，然后在4 ℃下与一抗过夜。用 PBST洗涤3次，每次10 min 后，将膜与二抗在室温下再孵育1 h。使用ECL 底物试剂盒以及凝胶成像系统ChemiDoc™XRS+（Bio-rad，美国）检测蛋白表达。
4. 细胞活力测定
取慢病毒感染培养的 Eca-109细胞接种到96孔板中。孵育0、24、48、72、96 h后。向每孔中加入20 μL的CCK-8溶液，置于5% CO2、37 ℃培养箱培养4 h。全功能微孔板检测仪（PerkinElmer/envision，中国）检测450 nm处的吸光度。
5. 迁移和侵袭检测
细胞迁移的检测：Eca-109细胞（每孔1×105） 重悬于无血清培养基，并接种于到上室，同时在下室加入10%的FBS（Thermo Fisher Scientific，美国）细胞培养基。培养24 h后，用4%多聚甲醇固定细胞，0.1%结晶紫进行细胞染色。在显微镜下观察成像情况并用Image J软件进行分析。细胞侵袭的检测：在Transwell实验装置（Corning，美国）的上室涂50 μL基质凝胶（BD Biosciences，美国），其余步骤与细胞迁移步骤一致。
二、统计学处理
采用 SPSS 21.0进行统计分析，计量资料采用Shapiro-Wilk 进行正态性检验，服从正态分布的资料以$\bar{x}±s$表示，2组间比较采用t检验，重复测量资料采用重复测量方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、RSRC1在ESCC中下调表达
qRT-PCR结果显示，与正常食管上皮细胞Het-1A组相比，RSRC1在人ESCC 细胞系（TE-1，Eca-109，EC9706）中的表达均下降（P均< 0.05）。见图1。因此，我们选择了RSRC1表达量相对较高的Eca-109细胞进行进一步研究。
二、RSRC1抑制ESCC细胞的增殖和转移
三、RSRC1可以调控PTEN/PI3K/AKT信号通路
讨论
ESCC是一种常见的人类恶性肿瘤，晚期ESCC患者的5年总生存率相对较低[12]。ESCC的发病机制尚未完全明晰，这使得难以发现晚期 ESCC的有效治疗方法。因此，进一步探索ESCC 病理生理学的分子机制对于开发 ESCC的新疗法非常重要。在本研究中，我们通过分子实验首次证明RCRC1在ESCC细胞中低表达，可能是ESCC中潜在的肿瘤抑制因子。先前研究发现，RSRC1通过调节转录因子雌激素受体β的SUMO化来抑制雌激素受体β转录活性。此外，RSRC1在肿瘤发展中起重要作用。Tang等[11]研究发现RSRC1基因多态性增加了儿童对神经母细胞瘤的易感性。Yu等[8]研究发现RSRC1可以抑制胃癌细胞的增殖和迁移。然而，RSRC1在ESCC发展中的作用尚未阐明。本研究通过CCK-8检测各组细胞活力，结果表明与对照相比，敲低RSRC1明显促进了Eca-109的细胞活力；通过Transwell实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力，结果显示与对照相比，敲低RSRC1明显增加了Eca-109中的迁移和侵袭细胞数量，首次发现RSRC1能够抑制ESCC细胞的增殖和迁移，这与前人研究结果一致，这一结果丰富了我们对ESCC发病机制的进一步认识，并提示靶向RSRC1可能是治疗ESCC的新策略。
有学者认为PTEN是一种肿瘤抑制基因，可以通过直接抑制PI3K/AKT信号通路来抑制癌症进展[13]。PTEN是一种调节细胞生长及存活的脂质和蛋白磷酸酶，被充分证明为关键的肿瘤抑制因子，可以在多种癌症（包括ESCC）中发挥肿瘤抑制作用[14⇓-16]。Kuo等[17]研究发现芝麻素能够通过促进 PTEN 表达抑制宫颈癌细胞增殖。Zhang等[18]研究发现miR-155通过下调PTEN促进ESCC的迁移和侵袭。更重要的是，PTEN是PI3K/AKT信号通路的负调节因子[19]。据报道，miR-93-5p可通过抑制PTEN的表达激活PI3K/AKT信号通路促进人视网膜母细胞瘤的进展[20]。蛇床子素通过激活PTEN 抑制PI3K/AKT信号通路诱导ESCC细胞的凋亡[21]。为了确定RSRC1抑制ESCC细胞增殖和转移的分子机制，我们通过查阅文献得到RSRC1通过促进PTEN表达抑制肿瘤进展，推测RSRC1和PTEN呈正相关，本研究通过生信分析发现PTEN在ESCC组织中表达下调，进一步通过蛋白免疫印迹法检测各组细胞中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关因子的表达，结果显示敲低RSRC1明显抑制了p-PTEN的蛋白表达，而敲低RSRC1明显促进了p-PI3K、p-AKT的蛋白表达，进一步研究发现RSRC1可以通过调节PTEN/ PI3K/AKT信号通路抑制ESCC细胞的增殖和迁移，这与前人的研究结果一致。
本研究证明RSRC1是ESCC中潜在的肿瘤抑制基因，并且能够抑制ESCC细胞增殖和转移以及调节PTEN/PI3K/AKT信号通路。因此，RSRC1可能是ESCC的潜在诊断生物标志物，可以作为ESCC治疗的新靶点，并在未来的药物开发中起到作用。然而，我们的研究还存在不足，缺少RSRC1在体内的研究，以及这种类型的调控是否与mRNA替代剪接有关。这也是我们未来研究的重要方向，我们将在细胞、分子以及动物实验对这一课题进行进一步的探究。
综上所述，RSRC1可能通过调节PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制ESCC细胞增殖和转移，为丰富ESCC的发病机制提供了新的方向，为RSRC1可以作为ESCC治疗的潜在靶点提供理论支持。