1 细胞因子概述
细胞因子主要有IL、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、IFN、TNF家族、生长因子[如转化生长因子（transforming growth factor，TGF）]和趋化因子[如单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IFN-γ诱导蛋白10（interferon γ inducible protein-10，IP-10）]等，其主要信号通路见图1。目前，细胞因子和细胞因子受体的单克隆抗体被广泛用于免疫、感染及肿瘤相关疾病的临床治疗。部分已成为免疫治疗二线药物，如托珠单抗靶向IL-6受体，被FDA批准用于治疗类风湿关节炎和细胞因子释放综合征等。单克隆抗体成本高昂，患者难以负担。核酸适配体不仅具有靶向性、循环稳定性及低免疫原性的优点，还具有低成本的优势，有望替代单克隆抗体成为免疫调控的靶向药物。
通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从大量不同序列组成的核酸文库中筛选和分离出能与靶标结合的单链RNA或DNA寡聚体称为适配体，筛选流程见图2。为增加富集池的目标选择性，一般设计加入关键干扰物进行反筛，减少体内应用的交叉反应性[13]。SELEX可以针对靶标样品的基质进行反筛，如表面带氰基的磁珠与血清孵育形成磁珠-血清蛋白进行反筛，以获得适于在体应用且对目标高亲和高特异的候选适配体[14]。本文阐述了上述8种信号通路相关特异性适配体阻断剂的种类、性能优化和治疗应用研究现状，通过总结目前细胞因子及其受体特异性适配体在免疫相关疾病治疗方面的应用潜力，为新型治疗制剂的研发提供指导。
2 IL-1α通路适配体抑制剂治疗策略
抑制IL-1α可能是一种有前途的抗感染治疗策略。因此，Ren 等[18]筛选出来的IL-1α的高亲和力（KD=7.3 nmol，KD为解离常数，其值越大代表亲和力越小）及高特异性适配体SL1067，经脱氧尿苷位的2-萘甲基取代形成的稳定态DNA以代替抗体，在细胞实验水平可抑制成纤维细胞生长，减少肝细胞引起急性期蛋白产生，调节T细胞和B细胞生长和分化，有望用于临床免疫治疗。
3 IL-6通路适配体抑制剂治疗策略
IL-6是由IL-1与TNF-α诱导产生的、固有免疫系统对损伤和感染最初反应所表达的多效细胞因子，参与自身免疫性疾病、炎症和部分癌症的发病机制[19]。同时，IL-6是影响体内炎症严重程度的激素样细胞因子，被认为是临床干预的重要靶点。IL-6介导的刺激诱导糖蛋白130（glycoprotein 130，GP130）同质二聚化，随后磷酸化的Juns激酶（Juns kinase，JAK）激活信号转导与转录激活因子1（signal transduction and transcription activation factors 1，STAT1）和STAT3形成同源二聚体或异源二聚体，诱导各种基因的激活[6,20]。
针对IL-6受体抑制剂的托珠单抗已开展临床应用研究[21]，如在急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）心肌挽救中发挥作用[22]。为降低成本，Gupta等[23]筛选了针对人类IL-6的DNA适配体SL1025（KD=0.2 nmol），PEG化的适配体SL1026通过结合IL-6抑制T细胞中STAT3磷酸化，用于治疗胶原诱导的关节炎[24]。针对IL-6受体位点的适配体阻断剂也备受关注，如Mittelberger等[25]筛选了34 nt 的RNA适配体RAID3用于阻断IL-6R。Ando等[26]获得解离常数为200 nmol的IL-6信号通路拮抗剂，该拮抗剂可抑制新型冠状病毒感染（corona virus disease 2019，COVID-19）导致的细胞因子释放综合征。除了RNA适配体，由32个氨基酸组成的肽适配体及其富二硫化物可代替IL-6R单克隆抗体[27] 。另外，Takamori等[28]进一步从随机肽库中筛选了一个新的13mer非天然的间（氯甲基）苯甲酸环化肽适配体，环化增加了肽的蛋白酶抗性，其可以结合IL-6R的胞外结构域，有望在IL-6/IL-6R信号转导的多种诊断和治疗方案中应用。
4 IL-17A通路适配体抑制剂治疗策略
IL-17家族由6个具有强烈促炎作用的结构相关成分组成，分别是IL-17A~F，其中IL-17A是最重要的T细胞诱导炎症反应的早期启动因子[29]。IL-17A通过与相关受体IL-17RA和IL-17RC结合，胞内结构域编码保守的SEFIR结构域与适配器Act1相互作用，Actl含有与TNF受体相关因子（TNF receptor related factor，TRAF）家族蛋白结合的位点，与TRAF6结合可激活MAPK或TGF-β激活激酶1（TGF-β activate kinase 1，TAK1），这些因子共同触发靶基因转录[7]。该通路参与诱导趋化因子的表达以招募白细胞，同时通过刺激TNF-α、IL-1β和IL-6的释放而发挥炎症放大作用[30]。
IL-17A及其近亲IL-17F在免疫性疾病的治疗领域受到广泛关注。30mer RNA适配体Apt21-2（KD=48.5 pmol）与IL-17A结合可抑制IL-6分泌[26,31]。其PEG化适配体PEG21-2idT以剂量依赖性的方式抑制关节炎或神经症状的发展。后续研究者又分析了Apt21-2对银屑病炎症的效果，发现Apt21-2在成纤维细胞培养和成纤维T细胞培养中对IL-17A具有中和能力，然而适配体被上层皮肤角质形成细胞摄取，可能会导致其在真实皮肤治疗中失效[32]。另有研究者报道，IL-17适配体覆盖氧化铈纳米颗粒明胶对脑炎治疗有显著效果[33]。IL-17A和IL-17F常以同型二聚体或异型二聚体配合物存在于细胞膜，Adachi等[34]针对IL-17A/F的异质二聚体全局构象筛选适配体AptAF42，优化后的衍生物AptAF42dope1有望成为首个针对IL-17A/F的抑制物。
5 TNF-α通路适配体抑制剂治疗策略
TNF-α是TNF家族中最先确定的成员，激活的单核细胞和巨噬细胞是TNF-α的主要来源。TNF-α信号转导是免疫系统的重要组成部分，具有抑制肿瘤发生、阻止病毒复制的作用，并且是诱导发热和细胞凋亡的内源性热原。TNF-α通过与Ⅰ型受体（TNF receptor 1，TNF-R1；p55）或Ⅱ型受体（TNF receptor 1，TNF-R2；p75）结合，激活不同的信号转导途径，平衡促炎或抗炎效应，其中以TNFR1信号转导为主，启动核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途径的激活及诱导死亡信号转导[8]。
中和TNF的生物制剂是慢性炎症和自身免疫性疾病最有效的治疗药物，菌血症期间输注抗TNF-α单克隆抗体，可抑制IL-1和IL-6释放[35]。DNA适配体有潜力成为TNF单抗替代品。Orava等[36]首次用25碱基单链DNA适配体VR11特异性地与TNF-α结合，减少体外一氧化氮（nitric oxide，NO）产生，减轻炎症反应。此外，Lai等[37]探究了筛选的TNF-α适配体聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）衍生物可减轻肝细胞的急性损伤程度并增强肝组织的早期再生能力。Mashayekhi 等[38]为增强免疫抑制作用，制备二聚体形式的DNA适配体（KD=67 nmol），其抑制效果达到40%，而融合蛋白依那西普为60%。类似地，Shobeiri等[39]构建了T1~T4适配体二聚体，探究了其在低浓度下实现治疗小鼠银屑病的作用。利用腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、TNF-α适配体和聚合物苯基硼酸构建的聚合物/适配体/金纳米颗粒，能够通过清除活性氧并捕获TNF-α治疗腹膜炎[40]。上述研究均验证了阻断TNF-α促炎信号通路可缓解相关疾病症状，然而TNF-α-TNFR2介导的生存和繁殖功能被中断可能引起副作用。为此，Chu等[41]筛选了针对TNFR1的适配体，并验证其二价核酸适配体有望作为抗RA候选药。An等[42]进一步通过微针共递送IL- 6R抑制剂托珠单抗和特异性抑制TNFR1的适配体Apt1-67，验证了联合用药比单药更有效缓解小鼠的类风湿关节炎。
6 TGF-β通路适配体抑制剂治疗策略
转化生长因子β1是一个25 kDa的同源二聚体蛋白，主要来源于调节性T细胞[43]。TGF-β信号转导是通过膜蛋白多糖β聚糖作为一种共受体，收集TGF-β并提呈给受体即I型受体（transforming growth factor-β receptor 1，TGFBR1）和Ⅱ型受体（transforming growth factor-β receptor 2，TGFBR2），组装形成复合物。随后，TGFBR2磷酸化并激活TGFBR1激酶，而TGFBR1激酶结合转录因子SMAD2/3并磷酸化。这些SMAD与SMAD4形成三聚体复合物，并在细胞核内聚集，结合并转录激活靶基因座[9]。TGF-β通路异常可能导致多种疾病发生，如肿瘤、组织纤维化、心血管疾病和免疫性疾病等。
7 IFN-γ通路适配体抑制剂治疗策略
8 趋化因子MCP-1通路适配体抑制剂治疗策略
Kulkarni等[59]报道了一种L-对映体RNA寡核苷酸适配体，称为mNOX-E36，可在小鼠体内或体外与MCP-1高亲和力结合并中和其作用，是目前针对MCP-1的唯一高亲和力适配体，可以阻止白细胞与内皮细胞结合，并抑制白细胞外渗至炎症部位，适配体mNOX-E36不仅在小鼠中显示出疗效，并在药代动力学研究中证明了其适用性，且没有免疫刺激的不良反应，为治疗狼疮性肾炎提供了一种新的有潜力的方法。此外，CCL2特异性mNOX-E36与CXCL12特异性阻断剂NOX-A12联用，对提高胰岛移植和1型糖尿病小鼠模型的胰岛存活率也具有良好效果[60]。近期研究将该适配体注射至小鼠原位4T1三阴性乳腺癌肿瘤，实现调节肿瘤相关巨噬细胞浸润和极化，使血管正常化以改善肿瘤靶向药物递送[61]。
9 趋化因子 IP-10通路适配体抑制剂治疗策略
趋化因子CXCL10是仅77个氨基酸的小型细胞因子，受IFN-γ刺激释放，因此也称为IP-10。IP-10可促进T细胞与内皮细胞的黏附，抑制骨髓细胞集落形成和血管生成。CXCL10通过结合CXCR3受体激活ERK、p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路，其中p38、PI3K/Akt和cAMP依赖性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信号通路调节人嗜酸性粒细胞、肺细胞和上皮细胞的趋化性[12]。
目前已经筛选出一组针对IP-10的高亲和力且具有核酸酶抗性的RNA适配体。Marro等[62]从中选择了最高效的一条进行截短，并在3'-端进行聚乙二醇化（KD=1.6 nmol），将其修饰为稳定的长度仅34 nt的RNA适配体，是迄今为止报道的CXCLI0/CXCR3信号通路最有效的拮抗剂，可有效抑制哮喘。
10 结论与展望
目前多种适配体已经在体外进行测试以明确其治疗效能，但其代替抗体用药仍然达不到临床期待，主要局限在于体循环的稳定性和复杂基质环境影响结构而易导致脱靶效应。为提高在体给药发挥效用的成功率，需在筛选过程中引入真实应用环境介质中的蛋白进行负筛，对SELEX过程进行质量控制，以优化核酸适配体的亲和力和特异性；通过改造糖环等修饰途径防止核酸快速降解；同时靶标与单链RNA或DNA结合的微观分子机制需明确才可实现适配体结构有效改造。本文总结了当前基于细胞因子或其作用受体的特异性核酸适配体作为免疫抑制剂的最新进展，并归纳了提高其应用稳定性及亲和力的方法，见表1。8种促炎细胞因子及相关受体特异性适配体可抑制信号转导，从而减缓炎症或自身免疫性疾病，核酸适配体可能会给生物科学带来革命性的变化，有望作为一种低成本、易改造、低毒副作用、易保存的识别分子用于靶向治疗，但推动适配体成药仍然需要广大科研人员深入探索。
表1 细胞因子及其受体的特异性适配体在免疫性疾病治疗中的应用Table 1 Application of specific adapters for cytokines and their receptors in the treatment of immune diseases |
| 靶 标 | 适配体碱基排序（5'→3'） | 长度/nt | 适应证 | 修饰 | 参考文献 |
|---|---|---|---|---|---|
| IL-1α | SL1067：CGUGAGUUAUGGGUUA GAGUCGT | 23 | 2型糖尿病、癌症、恶病质、白血病、牛皮癣、血管疾病和瘢痕性痤疮等 | 5-（2-萘基羧酰胺）-脱氧尿嘧啶（2Nap-dU）取代dT | [18] |
| IL-6 | SL1025：GGCAGGZZEGGPAZZAA CACGZZAAGZCGZGG-idT （Z=苄基、P=萘基、E=苯乙基） | 32 | 类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症和多发性骨髓瘤等 | SL1025由10个疏水基团修饰（8个苄基、1个萘基和1个苯乙基），且3'端插入dT SL1026由SL1025聚乙二醇化。 | [23-24] |
| RAID3：GGGAGAACUGUGGGAGUG GAGGGUGGAUGGUUCU | 34 | 2'-OH嘧啶替换为2'-F嘧啶（2'-F-Py） | [25] | ||
| IBR：GGAUUAAGGAGGUGAUAUUU AUGUAGAUGUAGUAUUCCUACGAA GUAUUAUUCUUCUUGCGGUGGAGG AGGAGGUAGCUA | 80 | [26] | |||
| IL-17A | Apt21-2：GGGAGCAGGAGAGAGGUC AGAUGGUCUAGCCGGAGGAGUCAG UAAUCGGUAGACCUAUGCGUGCUA GUGUGA | 72 | 银屑病，脑炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎等 | Apt21-2的5'端加40 kDa PEG，3'端idT修饰 | [31] |
| TNF-α | VR11：TGGTGGATGGCGCAGTCGG CGACAA | 25 | 类风湿关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病等 | [36] | |
| dimer：TCCGATCGGTGGGCCCGTC GGATTTTTTTTTTGGTCAGTACGTC TGACC | 49 | T1和T4与10个寡核苷酸（dT）连接成二聚体适配体 | [39] | ||
| TNF-R1 | Ap1：ACGTCGTATCGAGATAGCACT ACTCTTGACCGAAGGGGGACTGCT CGGGATTGCGGATATTCGGTCACTG ACTACG | 76 | 类风湿关节炎等 | Ap1与Ap2均截短保留加粗部分序列，且延长互补链组装成二聚体 | [41] |
| Ap2：ACGTCGTATCGAGATAGCCAG GGCCTGGGCTAAGTGACCGTGGGCT GGTTGGGTTTGGATTCGGTCACTGA CTACG | |||||
| TGF-β | T18_1_3：TGTCGTTGTGTCCTGTACC CGCCTTGACCA | 30 | 肿瘤、组织纤维化、心血管疾病和免疫性疾病等 | 5'腺苷和胞嘧啶硫代磷酸修饰 | [49] |
| IFN-γ | B1-4：CCGCCCAAATCCCTAAGAGAAG ACTGTAATGACATCAAACCAGACACAC ACACGCA | 56 | 感染性疾病、风湿性关节炎、SLE等 | [54] | |
| Fc-C6-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTGT CCAACCCC-C3-biotin | 31 | 阿司匹林通过π-π堆积力嵌入到适配体的双链5'-GC-3'序列中 | [55] | ||
| MCP-1 | mNOX-E36：GGCGACAUUGGUUGGG CAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAA UCCGC GGCCA | 50 | 狼疮肾炎、自身免疫性支气管炎、动脉粥样硬化、多发性硬化、神经性疼痛和癌症等 | L型对映异构体RNA适配体 | [59] |
| IP-10 | C44-62：GGGAGAUGCGGCAUGCGU CUGACCUACGUGCCAAGCAUUUGU GUAACCCGUCAGACGACUCG | 62 | 皮肤病、动脉粥样硬化、多发性硬化症、异体移植排斥反应等 | 抗人CXCL10适配体由71个核苷酸截短到56个，再添加6个核苷酸；且将5'端聚乙二醇化，3'端插入dT，防核酸酶降解 | [62] |