缺损组织和受损器官的修复与重建一直是医学界的重要挑战，修复与重建效果不佳不仅给患者带来了长期困扰，也成为其家庭和医疗保健系统的经济负担[1]。对此，利用组织工程和再生医学技术开发人工的组织工程展现出了巨大潜力，部分成果已经转化为实际的治疗措施[2-3]。其中，组织工程的血管化程度与速度是其存活与发挥功效的关键影响因素[4]。研究者常将间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和内皮细胞与组织工程结合并将其用于血管化研究。目前的组织工程构建策略以简单地将MSCs与内皮细胞混合于生物材料形成混悬液后进行打印为主，这会导致多种细胞无序随机散在分布。然而，人体内各种细胞在细胞外基质中的分布并不如此，而是更为有序地分布于不同的位置。例如，内皮细胞在体内往往是紧密连接并贴附于中空的管道内表面，而MSCs等支持细胞则散在分布于管壁外甚至更远的基质中。因此，本研究团队在进行组织工程构建时，进行了2种细胞的仿生分布设计，通过结合同轴喷嘴与传统3D打印技术，以简单步骤实现组织工程中细胞的分区分布，成功构建了MSCs与内皮细胞2种细胞分区分布的仿生支架，并探讨了其在促进血管生成方面的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
人类脂肪来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）购自美国SciencellTM研究实验室，人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cellsHUVECs）以及表达绿色荧光蛋白的HUVECs（GFP-HUVECs）购自Lonza（Walkersville，MD）。杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清和1%青霉素-链霉素均购自Gibco公司。细胞膜红色荧光染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）、苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基-磷酸锂盐（lithium phenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP）和蓝色光源（3 W，405 nm）购自苏州智能制造研究院。明胶购自Aladdin公司。阿尔玛蓝细胞增殖检测试剂盒购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。生物3D打印机（Livprint norm）购自中国广州迈普再生医学科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将细胞放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，在细胞生长到融合度约80%时进行传代，每隔一日更新一次培养基。
1.2.2 染色标记间充质干细胞
使用细胞膜红色荧光染色试剂盒对MSCs进行细胞膜染色标记。按照制造商的说明书制备染色工作液。将MSCs培养瓶中培养基吸走，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3遍，然后加入5 mL的1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（Dil）染色工作液，将培养瓶置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育30 min。吸收染料工作液，用DMEM洗涤3次后，加入完全培养基，在荧光显微镜下观察。
1.2.3 构建间充质干细胞与内皮细胞3D仿生分布设计支架
构建MSCs与HUVECs的3D仿生分布设计组织工程（Shell-Core支架）。分别制备含细胞的壳通道和核通道生物墨水。壳通道生物墨水：采用DMEM制备包含LAP（质量与体积比为0.3%）的GelMA溶液（质量与体积比为5%），然后用过滤精度为0.22 μm的过滤膜（Millipore Corp，Burlington，MA，USA）过滤GelMA溶液。核通道生物墨水：采用DMEM制备明胶溶液（质量与体积比为5%）。分别用壳通道生物墨水和核通道生物墨水重悬MSCs沉淀和HUVECs沉淀。MSCs最终浓度为1.5×106个/mL，HUVECs最终浓度为5×106个/mL。将上述生物墨水分别泵入同轴喷嘴的壳通道和核通道，通过生物3D打印机构建Shell-Core支架。打印设置参数：支架大小为10 mm×10 mm×2 mm，同轴喷嘴内通道直径约为200 μm，外通道直径约为550 μm，内通道生物墨水的挤出速度为0.5 mL/min，外通道生物墨水的挤出速度为3 mL/min，打印速度为10 mm/s，打印环境温度为21 ℃，接收平台温度为10 ℃。支架按上述参数进行打印，打印后立即用波长为405 nm、强度为100 mW/cm2的蓝光照射40 s，使GelMA完全光交联，然后用生理盐水清洗3次，加入完全培养基，在37 ℃和5% CO2的培养箱中进行培养及后续实验。
构建MSCs与HUVECs随机散在分布的组织工程（3D-Mix支架）。将MSCs与HUVECs按1∶1比例混合于壳通道的生物墨水中，2种细胞的最终浓度均为1.5×106个/mL，用普通喷嘴直接进行3D打印。体外培养条件与Shell-Core支架一致。
1.2.4 细胞增殖实验
使用阿尔玛蓝细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖能力。Shell-Core支架被均匀地切成4份，并分别放置在24孔板中培养。2D平面混合培养组（Co-culture组）的细胞培养如下，将MSCs与HUVECs按1∶1比例接种于6孔板，每孔最终接种0.8×105个细胞，培养基与Shell-Core支架一致，均置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。按照制造商的说明书配制工作液，检测时，吸出被检测孔中的培养基，用PBS清洗3次，每孔加入2 mL工作液，同时在空白孔中加入工作液作为空白对照孔，于37 ℃下孵育5 h。随后在每个孔板孵育的工作液中吸取100 µL转移到96孔板上，并在570 nm和630 nm处测量吸光值（optical density，OD），将空白对照孔的工作液测得的OD作为基线。每次检测完毕后吸去剩余的工作液，每孔用PBS清洗3次，并更换新鲜培养基继续按上述培养条件进行体外培养。每个样品分别在培养至第1、4、7日进行检测。
1.2.5 细胞划痕实验
通过细胞划痕实验评估3D仿生分布设计是否影响支架的旁分泌，并通过旁分泌的方式对HUVECs迁移产生影响，从而影响血管化。实验共分为3个组，分别为空白组（DMEM组）、作为对照组的3D-Mix组、实验组Shell-Core组。体外培养的第4日，3D-Mix组与Shell-Core组均倒去培养基，用无血清DMEM清洗3次，每孔加入2 mL无血清DMEM，在37 ℃和5% CO2的培养箱中孵育24 h，分别收集上清液作为条件培养基（conditioned medium，CM），1 500转/分离心10 min，于-80 ℃下保存待进一步使用。在6孔板中接种HUVECs进行培养，待其细胞汇合度达到80%左右，用PBS清洗2次，加入新鲜无血清DMEM饥饿处理过夜，再用1 000 μL移液管尖在单层HUVECs中划出一条条状空白区域（即划痕）。随后立即用PBS轻柔清洗2次以去除脱落的细胞，将Shell-Core-CM以及3D-Mix-CM解冻加热至37 ℃，分别加入至带细胞划痕的6孔板孔中，空白组的孔中则加入无血清DMEM。分别在0 h和24 h用显微镜观察拍照，通过测量HUVECs沿划痕区域宽度缩小的距离来量化迁移/增殖水平。划痕宽度缩短距离为0 h划痕宽度与24 h划痕宽度之差。
1.2.6 支架血管化比较
评估Shell-Core支架的结构保真性、结构的维持时长以及打印后支架在不同时间的演变，以探究3D仿生分布设计对支架功能化的影响。具体来说，同时构建Shell-Core支架和3D-Mix支架，在打印后当日与第7日在光学显微镜和荧光显微镜下观察2种支架血管化情况并拍照。其中在荧光显微镜下，Dil-MSCs显示为红色，GFP-HUVECs显示为绿色。
1.2.7 定量实时聚合酶链反应
为了评估3D仿生分布设计对支架血管生成基因表达的影响，将Shell-Core组与3D-Mix组体外培养7 d，分别提取支架总RNA，评估基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）的表达。按照制造商的说明书提取总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录。根据试剂盒的实验步骤进行实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。采用LightCycler 480 实时荧光PCR系统进行qRT-PCR检测。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为管家基因，每个样品测量3次。相对基因表达量采用2-∆∆Ct法进行计算。
1.2.8 统计学方法
使用SPSS 22.0分析数据。符合正态分布数据以$\bar{x}±s$表示。2组间均数采用Student t检验进行比较，多组均数比较采用单因素方差分析，采用LSD-t法进行两两比较，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 成功构建Shell-Core支架
采用同轴喷嘴（图1A），结合传统的堆叠式3D生物打印机，以实现2种生物墨水在喷嘴的不同部位被同时挤出，2种细胞精准分区，沉积壳层、包裹核层，组成壳-核结构条状纤维（图1B），这种异质结构的条状纤维在接收平台上平行排列逐层累积，从而完成整个Shell-Core支架的构建。支架构建后在体外培养第2日，可观察到核通道内的HUVECs黏附于中空通道的内壁并由载MSCs的壳层包绕（图1C）。为了更好地观察支架内细胞的分布，使用Dil-MSCs（红色）与GFP-HUVECs（绿色）进行打印，在体外培养第7日于荧光显微镜下观察，GFP-HUVECs仍紧密连接成细胞索道分布于核通道，Dil-MSCs均匀散在分布于壳通道材料中（图1D），实现了使MSCs与HUVECs按设计精准分区沉积。经观察，这种仿生结构可以至少保持到构建后的第7日。
图1 间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞3D仿生分布设计组织工程支架的构建注： A为同轴喷嘴外观；B为含MSCs的壳通道生物墨水与含HUVECs的核通道生物墨水同时挤出形成仿生分区的条状纤维横切面与纵切面示意图；C为体外培养第2日光学显微镜下所见（×200，标尺为200 μm）；D为培养第7日荧光显微镜下所见，Dil-MSCs显示红色，GFP-HUVECs显示绿色（×200，标尺为200 μm）。 Figure 1 Tissue engineering scaffold of a 3D bionic distribution design scaffold for mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells |
2.2 细胞增殖实验
Shell-Core组体外培养第4日的细胞增殖比Co-culture组慢（1.221±0.135 vs. 1.372±0.080，P <0.05），但随着培养时间增加，支架中细胞增殖速度明显增加（图2），在第7日可以观察到支架中细胞增殖速度超过Co-culture组的增殖速度（1.996±0.056 vs. 1.530±0.060，P < 0.01）。
2.3 细胞划痕实验
各组在划好划痕后分别用无血清DMEM、3D-Mix-CM或Shell-Core-CM处理24 h。结果显示，在24 h时，Shell-Core-CM处理的HUVECs划痕缩短距离明显大于3D-Mix组和DMEM组[（431.6±33.6）μm vs.（378.7±22.5）μm vs.（302.3±20.1）μm，均P < 0.01]，提示MSCs与HUVECs 3D仿生分布设计通过旁分泌的方式促进HUVECs迁移，从而有效血管化（图3）。
2.4 支架血管化与qRT -PCR结果
打印后当日，MSCs和 HUVECs按3D仿生分布设计精准分布于Shell-Core支架中相应的位置，而在3D-Mix支架中，2种细胞则随机散在分布。体外培养第7日可以观察到HUVECs在中空通道内表面覆盖并相互连接，初步形成了血管化通道。在支架中多个部位也可以观察到自组装的内皮细胞芽，且越接近预制的内皮管道自组装的内皮细胞芽密度越高。而在3D-Mix支架中，HUVECs仅在原位增殖呈细胞团，几乎见不到Shell-Core支架中HUVECs自组装现象。
通过qRT-PCR比较了Shell-Core支架和3D-Mix支架的MMP-9基因的表达。结果显示Shell-Core支架MMP-9的mRNA表达量是3D-Mix组的（1.55±0.06）倍（P < 0.01），提示3D仿生分区设计可能通过上调MMP-9的表达促进HUVECs的迁移和血管生成（图4）。
图4 间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞3D仿生分布设计组织工程支架中人脐静脉内皮细胞的体外自组装注：A为体外培养第0和7日荧光显微镜下所见的细胞分布（×100，标尺为200 μm），Dil-MSCs显示红色，GFP-HUVECs显示绿色；B为MMP-9的mRNA相对表达量比较；**P < 0.01。 Figure 4 In vitro self-assembly of human umbilical vein endothelial cells in the 3D bionic distribution design tissue engineering scaffold of mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells |
3 讨论
传统的组织工程常将MSCs、多能干细胞等引入合适的支架并植入体内以治疗组织缺损[11]。然而，当植入物细胞致密或者体积较大的时候，常难以实现移植物中心区域快速血管化，致使氧气和营养物质以及代谢废物高度依赖简单扩散进出组织，会出现移植物中心坏死导致移植失败，从而影响组织修复的效率[12]。快速和充分的血管形成对于移植后的组织工程移植物中细胞存活与发挥功能作用显得至关重要。为了克服这些问题，有必要制定血管化策略，旨在使组织工程移植物移植入体内后能快速有效地血管化[13]。目前组织工程的血管化策略主要是在组织工程中添加各种生长因子、小分子药物等促进血管生成，侧重于刺激血管从周围组织长入移植物，但这个过程通常非常缓慢[7]。研究表明，新生血管的生成速度约为5 μm/h[14]，这也意味着即便是厚度仅2 mm的移植物仍需几个星期才能完全血管化，这依赖于添加物的稳定长期释放。因此，组织工程不应该仅依赖于简单的成分添加。
部分研究表明，细胞图案化空间分布的仿生设计可使组织工程在体外实现预血管化，并在组织工程移植进体内后快速血管化，从而更好地实现修复效果。MSCs和内皮细胞常常结合组织工程被用于血管化研究，传统的组织工程构建策略[15-16]仅简单将这些细胞混合于生物材料形成混悬液后进行打印，以构建多种细胞无序随机散在分布的组织工程[17-18]。而图案化的异质结构设计能使不同细胞更有序地分布于不同的位置，以达到2种甚至多种细胞的仿生分布设计[19]。如内皮细胞在体内往往是紧密贴附中空的管道内表面，而MSCs等支持细胞则散在分布于管壁外甚至更远的基质中。部分研究显示，通过在移植物移植前构建微血管网络，能有效促使移植物在植入体内后快速血管化，甚至直接与宿主的微血管融合从而实现更早期的血液灌注[20]。因此，本研究在进行组织工程支架构建时，将3D打印与同轴喷嘴结合，将MSCs置于壳通道材料，巧妙利用壳通道中GelMA的特性，并置内皮细胞于核通道的牺牲材料中。2种通道同时于同轴喷嘴挤出，在单一步骤中实现细胞的分区分布，成功实现2种细胞的图案化仿生分布。可以观察到，在本研究构建的Shell-Core支架中，GFP-HUVECs之间相互连接并黏附于中空管道内壁，以模拟真皮组织中密集的血管结构，MSCs则分布于管壁外基质中，以模拟真皮组织中的干细胞分布。在长时间体外培养的观察中，2种细胞精准分区沉积的3D仿生分布设计能够在体外保持稳定，使2种细胞在支架内实现仿生的空间分布，明确了该支架有较好的结构保真性，同时为后续构建多种细胞且更复杂的仿生组织工程奠定基础。经观察，本研究的Shell-Core支架在体外能长时间培养，且能够维持高的增殖活性。
本研究对Shell-Core支架功能化进行了初步探讨，Shell-Core支架在体外通过促进HUVECs迁移、促进其自组装等而表现出一定的功能化。在显微镜下可以观察到，HUVECs不仅紧密覆盖于核通道内表面，而且向四周的壳通道材料迁移萌芽、自我组装，从而形成各种尺寸的内皮细胞芽。研究表明，与单个细胞的接种方式相比，在水凝胶中以细胞团接种的形式能更快促进体外预血管化，这可能与图案化设计能提高局部内皮细胞的浓度有关[21]，且MSCs具有促进内皮细胞自组装的作用[22]，与本研究的结论一致。这种3D仿生分布的设计允许内皮细胞在中空管道内表面伸展并直接接触，局部提高了内皮细胞浓度，能早期实现内皮细胞的直接接触交流。目前的研究已经证实了MSCs可以通过促进血管化而实现组织修复[23]。本研究构建的Shell-Core支架不仅能在体外直接预制血管通道，且诱导内皮细胞快速自组装并向管壁外生芽，迅速实现组织工程的体外多级血管化，且能通过旁分泌的方式促进内皮细胞迁移从而促进血管化。大量研究表明，各种MMP在血管生成过程中起着关键作用，尤其是在促进血管萌发方面[24-26]，本研究显示Shell-Core支架的MMP-9表达增高。因此，该支架除了能实现内皮细胞与支持细胞仿生分布设计之外，还实现了支架的功能化。
综上，本研究提出了一种将MSCs与内皮细胞进行3D仿生分布设计的打印策略，通过同轴喷嘴与传统3D技术成功打印出2种细胞仿生分布的组织工程支架，且实现了这种仿生设计结构的高度保真性，为组织工程血管化提供了简单策略。除此之外，本研究进一步明确了这种3D仿生设计在体外的促进血管化作用，提示这种仿生设计或具有较大的应用前景。本研究仍存在一定局限性，未能明确该支架预制的内皮通道及其体外自组装形成的血管网络是否直接与宿主血管网络吻合从而实现早期灌注，这也是未来研究的侧重点。未来，可以考虑引入多种细胞、设计更为复杂的仿生分布，为解决组织缺损的修复提出新方案，甚至为制造血管化的器官工程提出新方案，也可为药物测试、研究血管发生等提供新的组织模型。