截至2024年，乳腺癌已成为全球发病率排名第二的癌症（11.6%），仅次于肺癌（12.4%），作为女性发病率最高的癌症，乳腺癌的早期诊断与治疗显得尤为重要[1]。乳腺癌是一种复杂的异质性疾病，受遗传、分子、细胞、组织特异性、环境、种族和社会经济因素的调节。传统的诊断方法包括影像学及病理学诊断，尽管病理学检查在临床中被视为“金标准”，但仍不能评估肿瘤分子异质性，无法揭示肿瘤克隆多样性及其动态演变规律，亦无法提供精准治疗策略[2]。乳腺癌的常规治疗手段包括外科切除、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗、靶向治疗及免疫治疗[3]。尽管乳腺癌诊断与治疗的基本原则已经达成了共识，但随着精准医疗的发展，个体化治疗显得尤为重要，在这种背景下，基于患者体液而非癌灶组织的液体活检为患者带来了福音。液体活检在过去几年中迅速发展，相较以往的技术手段揭示了更多关于肿瘤特征的细节，如肿瘤进展、肿瘤分期、异质性、基因突变和克隆进化等。本文旨在总结液体活检在乳腺癌中的应用进展及对比传统组织活检的优劣。
1 液体活检的定义
液体活检在21世纪初逐渐进入大众视野，是指从各种生物液体（通常是血液）中分析肿瘤特异性生物学标记物（循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA等）进而获取肿瘤信息的一项新技术，不同于传统组织活检检测肿瘤组织中蛋白质的免疫组织化学及细胞形态学[4-5]。肿瘤患者的血液中含有多种肿瘤细胞释放的生物物质，包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、肿瘤来源的细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）、血小板及外泌体等[6]，这些由肿瘤释放并沉积到血液中的物质是特异性的，可以准确区分正常人与肿瘤患者。液体活检最先被用于发病率最高的肺癌，帮助医师早期发现肺癌，且在肿瘤筛查和病情监测方面发挥着重要作用[7-8]。液体活检因其无创性及监测连续性被广泛应用于临床，加速了精准医学的发展[9]。
2 液体活检的检测靶点
液体活检的主要靶点有CTC、ctDNA与EV，不同靶点具有不同的特点（表1）。
表1 液体活检靶点的比较Table 1 Comparison of liquid biopsy targets |
| 靶 点 | 优势 | 劣势 | 应用 |
|---|---|---|---|
| CTC | ①具有肿瘤来源特异性 ②通过DNA、RNA及蛋白质均可获得 ③能够进行体外试验 | ①检测灵敏度较低，漏检率高 ②技术挑战大，分离和富集难度高 ③临床标准化不足，可重复性较差 | ①预后分析 ②疗效评估 ③复发监测 |
| ctDNA | ①全面反映肿瘤突变信息 ②肿瘤相关突变特异性高，与靶向药物关系明确 | ①难以确定组织来源 ②突变频率通常较低，区分肿瘤变异与背景噪音的技术难度较高 | ①个性化用药指导 ②疗效及耐药监测 ③早期辅助诊断 |
| EV | ①通过非编码RNA、DNA及蛋白质均可获得 ②能够进行体外试验 ③适用性广，作为早期筛查标志物的潜力更大 | ①目前仍缺乏明确的特异性标志物 ②肿瘤外泌体的进一步纯化难度高 | ①早期筛查 ②转移调控 |
2.1 循环肿瘤细胞
CTC是指从原发肿瘤或转移灶脱落，进入外周血液循环系统的完整肿瘤细胞[10]，通常在循环中只持续存在1~2.5 h，然后被免疫系统破坏，但仍有一小部分可以存活并播种于远处转移部位[11]。乳腺癌可以通过血液传播转移，癌细胞会随循环系统播散到全身[12]。CTC最初在患者外周血中发现，此后，学者们在异质血细胞群中提取CTC方面取得了巨大进展[13]。CTC的数量非常少，在每100万个白细胞中大约仅有1个[14]，其形态多变，随肿瘤分期而变化[15]，可黏附在成纤维细胞、血小板等细胞上形成聚集体。相比于未黏附的CTC，黏附的CTC在体内可扩散到更远的地方，后续研究证实其原因是这样的聚集体可以阻止氧化应激和周围的免疫系统对CTC的破坏[16-17]。现有的研究显示，在肺癌、胃癌、结直肠癌等多种实体肿瘤患者的血液中均可检测到CTC[18-20]。超过一半的乳腺癌患者体内能检测到CTC，这为监测乳腺癌提供了极大便利[21]。随着液体活检技术的不断发展，对CTC的检测从单纯的细胞计数发展到单细胞测序，可以通过研究CTC的基因组和转录组进一步了解乳腺癌的发生发展[22]。免疫磁珠阳性富集法的代表性技术CellSearch系统是目前唯一获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于临床的CTC检测技术[23]。Bidard等[24]应用该技术对1 944例转移性乳腺癌患者进行研究，发现其中911例患者治疗前CTC数量≥5个/7.5 mL，与CTC数量<5个/7.5 mL的患者相比，这部分高CTC计数患者的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）均明显缩短。
2.2 循环肿瘤DNA
细胞发生凋亡或坏死时会将DNA释放进入血液，称为游离DNA（cell free DNA，cfDNA），血液中的DNA酶可以快速降解cfDNA，因此cfDNA的半衰期很短，约为1~2 h[25]。cf DNA通常是长度为160~180个碱基对的短片段[26]。研究表明癌症患者的cf DNA水平远高于正常人，所以cfDNA最初被用于评估癌症患者的总体肿瘤负担，但最终因总cfDNA水平对于跟踪患者的总体肿瘤负荷和对治疗的反应不够敏感及特异性低等缺点而无法被广泛应用[27]。对于肿瘤细胞而言，其释放到循环中的DNA被称为ctDNA，属于cfDNA的一种[28]。目前对于ctDNA的研究限于碱基对长度以及形态学修饰，其中杂合性缺失（lack of heterozygosity，LOH）、DNA甲基化、DNA完整性是当前研究热点[29-30]。对ctDNA定性、定量与追踪可提供肿瘤遗传变异信息，在全程管理肿瘤患者中的应用价值已在多个临床诊疗指南中被描述[31-32]。目前ctDNA检测技术可以概括为2种：①基于PCR的检测技术，主要包括扩增阻滞突变系统PCR（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）、微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和基于小珠（Bead）、乳浊液（Emulsion）、扩增（Amplification）、磁性（Magnetic）的BEAMing技术；②基于高通量测序的检测技术，包括靶向测序、全外显子测序和全基因组测序等。Nik-Zainal等[33]通过对560例乳腺癌患者进行全基因组测序分析，鉴定出93个与乳腺癌发生发展密切相关的蛋白编码癌基因，这些基因共包含1 628个潜在的驱动突变位点。在乳腺癌检测中，ctDNA凭借高灵敏度、全面基因组覆盖、无创动态监测和成熟的临床转化，已成为液体活检动态监测的首选技术，尤其适用于早期复发预警、耐药机制解析和精准治疗指导[34]。
2.3 细胞外囊泡
EV是由细胞分泌的一种异质性结构膜群，会穿越细胞膜进入细胞的内环境，存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液等多种体液中[35-36]。EV由双层脂质所包裹，直径约30~2 000 nm[35]，内含各种生物信息分子，例如蛋白质和核酸等，EV形态和大小是目前判断分泌细胞状态和功能的标准[37]。根据大小EV被分为外泌体（exosomes）、微囊泡（microvesicles）和凋亡体（apoptotic bodies）。外泌体是一种较小的囊泡，直径约50~150 nm，形成于内泛素中，内泛素是一种细胞器，负责内吞和分解细胞内部的物质[38-39]；微囊泡是一种较大的囊泡，直径约50~500 nm，是通过细胞膜的脱落形成的，可以通过细胞膜上的突起成熟而分离出来[40]；凋亡体是在细胞凋亡过程中形成的较大囊泡，直径大于1 000 nm，当细胞凋亡时会释放凋亡体进入循环[41]。EV被细胞分泌后可随血液抵达身体的不同部位，且因其双层脂质结构而稳定存在于血液中，因此对于乳腺癌的早期监测和诊断均具有重要意义。
3 液体活检在乳腺癌中的临床应用现状
液体活检已被应用于乳腺癌的早期诊断、复发监测及预后评估，同时对治疗用药也有指导作用[42]。
3.1 早期诊断
目前，早期乳腺癌被认为是可以治愈的[43]，但由于乳腺癌早期症状不典型，大部分患者进展到晚期才被确诊，不仅失去了完全治愈的机会，治疗方式的选择也受限。大量证据表明液体活检有助于早期诊断乳腺癌，例如ctDNA在乳腺癌临床症状未出现前即可在外周血液中被检测到[44]，外周血ctDNA/cfDNA水平的变化可提示癌症初发，目前的检测方法能够检测到低至 1/100 000或 1/100 000拷贝的突变等位基因频率[45]。还有研究表明，乳腺癌患者血浆中检测到的ctDNA可用于无创肿瘤基因检测和量化肿瘤负担，能进一步反映肿瘤异质性和转移特异性，在癌症早期即可明确诊断[46]。此外，EV也凭借其高灵敏度及特异度，为乳腺癌的早期诊断提供了新路径。
3.2 复发监测及预后评估
3.3 辅助治疗
液体活检对乳腺肿瘤的治疗也有重要辅助作用。ctDNA有助于识别乳腺癌的特定突变进而辅助治疗，Cohen等[53]使用CancerSEEK（一种用于识别包括乳腺癌在内的8种癌症的泛癌血液检测方法）来评估16种ctDNA基因的突变，研究结果显示，检测乳腺癌的灵敏度为33%，特异度为99%[53]。Beaver等[54]评估了乳腺癌患者血浆中的PIK3CA突变情况，PIK3CA是一种高频率突变的致癌基因，30%的乳腺癌体内存在PIK3CA，PIK3CA检测早期乳腺癌的灵敏度为93.3%，特异度为100%[54]。因此Beaver等认为通过检测ctDNA能开发出更具特异性的乳腺癌治疗药物，协助临床医师在肿瘤进展过程中进行个体化治疗。
3.4 在乳腺癌不同亚型中的应用
3.4.1 Luminal型乳腺癌
3.4.2 人类表皮生长因子受体2阳性型乳腺癌
在人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性型乳腺癌中，ctDNA有助于预测抗HER2（如曲妥珠单抗、T-DXd）的治疗响应[57]，且ctDNA检测中的HER2信号消失与病理完全缓解（pathological complete response，PCR）相关[58]。CTC可被CellSearch或微流控技术分离，从而直接检测HER2蛋白表达（如IHC 3+或FISH+），克服肿瘤异质性带来的影响[59]。换句话说，在HER2阳性型乳腺癌中，ctDNA是基因水平动态监测的金标准，尤其适合靶向治疗耐药突变检测和早期复发预警；而CTC则提供细胞表型与功能信息，直接验证HER2靶点表达并解析异质性。ctDNA与CTC两者相辅相成，从分子到细胞层面实现“双保险”监测。
3.4.3 三阴性乳腺癌
三阴性乳腺癌是恶性程度最高的乳腺癌，通过检测ctDNA中肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）或特定突变（如BRCA1/2）可预测PD-1抑制剂对三阴性乳腺癌的疗效，CTC则可反映存活细胞中PD-L1上调等细胞表型的变化，两者均有助于精准治疗与耐药判断[60]。
综上，在不同分子分型乳腺癌中，CTC与ctDNA的动态变化对精准诊疗具有不同的指导意义，在临床中可以根据分子分型选择合适的液体活检检测靶点。
4 液体活检与传统组织活检的比较
传统的组织活检是通过穿刺、内镜或手术切除获取病变组织进行病理检查的“金标准”方法[2]。其主要技术包括细针穿刺（fine-needle aspiration，FNA）、空心针活检（core needle biopsy，CNB）和手术切除活检，通过HE染色、免疫组织化学（如HER2、PD-L1）和分子检测（如EGFR、KRAS）明确诊断，其优势在于可以直接观察组织结构和细胞形态，但具有侵入性且可能遗漏肿瘤异质性等缺点[61]。与传统组织活检相比，液体活检具有创伤小、费时短、保存条件要求不高等优点，同时又可以持续并实时监测患者对治疗药物的不良反应，重要的是有助于揭示肿瘤的时空异质性，这些都是传统组织活检无法实现的[62-63]。但液体活检相比于组织活检来说，其检测的灵敏度不够高，且无法在组织学层面上进行评估，因此目前只能作为传统组织活检的辅助技术[64]。在临床实践中，应将传统组织活检与液体活检联合应用，才能发挥各自的长处。
5 液体活检的局限性
液体活检需要从体液中获取样本，不仅个体间存在差异，与体液中的其他成分相比，CTC、ctDNA、ctRNA的含量相对较少，且会受微环境的影响，分离血浆所需的技术较高，此外，由于来源多样性、亚群复杂性以及易与非囊泡结构结合而缺乏有效的富集技术和分析方法，使得液体活检面临多种挑战[65-66]。一般情况下，对富集的CTC进行分析，可以在蛋白质或mRNA水平上鉴定出特定的肿瘤相关生物学标志物，但一些特殊肿瘤可能会影响检测结果。例如在上皮性肿瘤患者中，上皮性生物学标志物会在上皮向间充质转化（epithelial to mesenchymal transition， EMT）的过程中下调，这可能会导致假阴性结果[67]。此外，进行液体活检时还需要进行初步组织学检查，以避免对诊断结果的过分解读。毫无疑问，液体活检是一种高效的非侵入性诊断方法，可以提供全面的肿瘤分子谱和治疗肿瘤靶点的实时信息，但是需要开发新的技术和标准化的方法来克服阻碍液体活检在转化和临床实践中的限制。
6 结语与展望
液体活检作为一种无创诊断技术，在乳腺癌精准诊疗中的未来发展前景广阔。首先，在技术层面，多组学联合检测将大幅提高早期肿瘤的检出率，甲基化、片段组学等新标志物的应用有望实现超早期预警[70]。其次，液体活检的临床应用将从辅助诊断向全程管理扩展，动态监测肿瘤演变、预测治疗反应和耐药突变，为精准诊疗提供实时依据[71]。此外，随着检测成本下降和标准化流程建立，液体活检有望成为常规体检项目，实现肿瘤的早筛早诊[72]。尽管仍面临灵敏度提升和生物学标志物待优化等挑战，但液体活检技术的持续突破将为乳腺癌的防治带来新希望，推动肿瘤诊疗进入无创、动态、精准的新时代，在为患者提供个体化治疗和评估预后中都有重要意义。
利益冲突声明：本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。