促性腺激素释放激素拮抗剂（GnRH-ant）能与垂体GnRH受体结合,有效阻断内源性GnRH作用,迅速降低血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）水平。GnRH-ant无GnRH激动剂（GnRH-a）的一过性作用,且停药后48 h即解除对垂体的抑制作用。有研究发现,GnRH-ant方案能够有效缩短总治疗时间和减少促性腺激素（Gn）用量,且可降低卵巢过度刺激综合征（OHSS）发生率[1]。目前临床最常用的促排卵方案是在促排卵第5日或第6日添加GnRH-ant,即固定方案。但为了减少GnRH-ant的用量,Kolibianankis等[2]和Escudero等[3]提出了灵活方案,即当优势卵泡直径≥14 mm或优势卵泡直径≥12 mm且雌二醇>300 pg/ml时添加GnRH-ant。目前在GnRH-ant固定方案和灵活方案的选择方面仍存在一定争议。Hamdine等[4]研究显示,早期添加GnRH-ant可减少早发性LH峰的出现,从而避免过早排卵和减少卵泡黄素化,降低周期取消率。苏静等[5] 研究显示,灵活方案的妊娠结局并不劣于固定方案,且在减少GnRH-ant使用时间和用量方面存在明显的优势。本研究旨在比较GnRH-ant固定方案和灵活方案在新鲜移植周期的促排卵效果和临床妊娠结局,现报告如下。
对象与方法
一、研究对象
收集2015年12月至2018年5月在本中心采用GnRH-ant方案进行体外受精/单精子胞浆内注射-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）者的临床资料。所有夫妇均已签署知情同意书,本研究获中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①夫妇双方有IVF/ICSI-ET的指征;②采用GnRH-ant方案进行IVF/ICSI助孕;③均有可利用胚胎并在新鲜周期移植。排除标准：①有影响胚胎着床的因素,如子宫黏膜下肌瘤、宫腔粘连、子宫解剖结构异常等;②合并自身免疫性疾病或其他内分泌及代谢性疾病;③染色体异常需行胚胎植入前基因诊断的患者。
二、治疗方案
1. GnRH-ant固定方案
在月经周期第2 ~ 3日开始使用Gn,即重组FSH（rFSH,普丽康或果纳芬）,启动剂量75 ~ 300 U,根据患者的年龄、BMI、窦卵泡数而定。同时监测血清性激素水平（LH、雌二醇、孕酮）和卵泡发育情况。在启动后第5日或第6日添加GnRH-ant（思则凯）。当有2个或2个以上优势卵泡直径≥18 mm时,用5 000 ~ 10 000 U人绒毛膜促性腺激素 （HCG） 或250 μg重组HCG（艾泽）扳机。若患者有OHSS发生高风险,则采用双扳机,即0.1 mg GnRH-a（达菲林）联合2 000 U HCG。扳机后34 ~ 36 h取卵。
2. GnRH-ant灵活方案
启动时间和剂量参考固定方案,在优势卵泡直径≥14 mm或优势卵泡直径≥12 mm且雌二醇>300 pg/ml时添加GnRH-ant。其他性激素和卵泡监测、扳机时机同固定方案。
3. 胚胎移植和验孕
取卵后第3日或第5日在B超引导下进行胚胎移植。移植后12 ~ 14 d查血清β-HCG阳性即为生化妊娠。移植后5周行阴道B超,B超下见孕囊即为临床妊娠。种植率为孕囊数除以移植胚胎数。黄体支持一直持续到孕10周。
三、研究方法
根据患者采用的GnRH-ant方案分为固定方案组及灵活方案组,比较2组患者的基本资料、促排卵情况、妊娠结局差异,并根据女方年龄分为<35岁、35 ~ 39岁、≥40岁3个亚组,分别比较新鲜周期中不同年龄患者行固定方案与灵活方案的妊娠结局差异。
四、统计学处理
采用SPSS 21.0进行数据统计和分析。服从正态分布的计量资料以$\bar{x}$±s表示,2组间比较采用独立样本t检验;不服从正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）表示,组间比较采用非参数检验。计数资料以率表示,组间比较采用$\chi ^{2}$检验。为了控制混杂因素,进行了二元Logistic回归分析,纳入了年龄、Gn启动剂量、Gn总用量、促排时间、HCG注射日子宫内膜厚度、获卵数、移植胚胎数以及方案的选择,分析固定方案组与灵活方案组间的临床妊娠率差异。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、固定方案组与灵活方案组的基本资料和促排卵情况比较
共纳入1 321个周期,其中1 014个周期使用GnRH-ant固定方案,307个周期使用GnRH-ant灵活方案。2组患者的年龄、BMI、不孕年限比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。与灵活方案组相比,固定方案组的Gn启动剂量及总用量均较低、促排卵时间较短（P均<0.05）。2组患者HCG注射日LH水平和子宫内膜厚度相近（P均> 0.05）,但固定方案组的HCG注射日雌二醇和孕酮水平均高于灵活方案组（P均< 0.05）。固定方案组的获卵数、成熟卵子数和优质胚胎数均多于灵活方案组（P均< 0.05）,2组间正常受精率和取卵取消率比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见表1。
表1 固定方案组与灵活方案组的基本资料和促排卵情况比较 |
| 项 目 | 固定方案组（1 014个周期） | 灵活方案组（307个周期） | t/Z/$\chi ^{2}$值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | 34.1±6.0 | 34.7±6.5 | -1.505 | 0.143 |
| BMI（kg/m2） | 22.2±11.7 | 22.5±3.9 | -0.335 | 0.584 |
| 不孕年限（年） | 2.0（3.0） | 2.5（4.0） | -0.588 | 0.154 |
| Gn启动剂量（U） | 192±52 | 206±54 | -2.619 | <0.001 |
| 促排时间（d） | 9（1） | 9（3） | -4.844 | <0.001 |
| Gn总用量（U） | 1 722±559 | 1 952±610 | -3.925 | <0.001 |
| HCG注射日LH水平（mU/ml） | 3.62（2.58） | 4.05（2.85） | -1.566 | 0.122 |
| HCG注射日雌二醇水平（pg/ml） | 2 341（2 230） | 1 603（1 641） | -6.357 | <0.001 |
| HCG注射日孕酮水平（ng/ml） | 0.69（0.33） | 0.56±0.30 | 3.821 | <0.001 |
| HCG注射日子宫内膜厚度（mm） | 10.6（6.9） | 10.7（7.2） | -0.095 | 0.923 |
| 获卵数（个） | 10（11） | 7（8） | -6.946 | <0.001 |
| 成熟卵子数（个） | 7（4） | 6（4） | 3.955 | <0.001 |
| 优质胚胎数（个） | 3（4） | 2（3） | -4.594 | 0.008 |
| 正常受精率（%） | 74.4±21.1 | 76.1±23.5 | -0.777 | 0.224 |
| 取卵取消率[周期（%）] | 51（5） | 23（7） | 2.702 | 0.100 |
| 早发LH峰发生率[周期（%）] | 40（4） | 23（7） | 6.528 | 0.011 |
| OHSS发生率[周期（%）] | 25（2） | 7（2） | 0.034 | 0.812 |
二、固定方案组与灵活方案组的妊娠结局比较
共560个周期进行了新鲜周期移植,其中439个周期为GnRH-ant固定方案,121个周期为GnRH-ant灵活方案。固定方案组共移植826枚胚胎,其中移植第3日胚胎（D3）719枚、囊胚107枚,种植233枚（28.2%）;灵活方案组共移植217枚胚胎,其中移植D3 184枚、囊胚33枚,种植56枚（25.8%）。2组的胚胎移植种类（$\chi ^{2}$ = 0.751,P = 0.386）及种植率（$\chi ^{2}$ = 0.495,P = 0.482）比较差异均无统计学意义。2组周期的移植胚胎数、生化妊娠率、临床妊娠率和种植率比较差异亦均无统计学意义（P均> 0.05）,见表2。
表2 固定方案组与灵活方案组新鲜移植周期的妊娠结局比较 |
| 项 目 | 固定方案组（439个周期） | 灵活方案组（121个周期） | t/$\chi ^{2}$值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 移植胚胎数（个） | 1.88±0.45 | 1.79±0.53 | 1.872 | 0.062 |
| 生化妊娠率[周期（%）] | 207（47） | 54（45） | 0.243 | 0.622 |
| 临床妊娠率[周期（%）] | 192（44） | 50（41） | 0.225 | 0.635 |
三、不同年龄亚组行固定方案和灵活方案的妊娠结局比较
1.年龄<35岁者行固定方案和灵活方案的妊娠结局比较
对于年龄< 35岁者,固定方案组和灵活方案组的妊娠的HCG注射日内膜厚度、优质胚胎数、临床妊娠率和种植率比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）;与灵活方案组相比,固定方案组的Gn总用量较低、HCG注射日雌二醇水平较高、获卵数较多（P均< 0.05）,见表3。
表3 年龄< 35岁者行固定方案和灵活方案的妊娠结局比较 |
| 项 目 | 固定方案组（235个周期） | 灵活方案组（57个周期） | Z/t/$\chi ^{2}$值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| Gn总用量（U） | 1 400（600） | 1 800（900） | -4.018 | <0.001 |
| HCG注射日雌二醇水平（pg/ml） | 2 389±1 056 | 1 967±963 | 2.752 | 0.006 |
| HCG注射日子宫内膜厚度（mm） | 11.1（8.9） | 11.9（10.0） | -0.420 | 0.675 |
| 获卵数（个） | 11.0±5.0 | 8.2±4.4 | 3.878 | <0.001 |
| 优质胚胎数（个） | 3 （4） | 2（3） | -1.365 | 0.168 |
| 临床妊娠率[周期（%）] | 126（54） | 28（49） | 0.372 | 0.542 |
| 种植率[种植胚胎数/移植胚胎数（%）] | 158/435（36） | 30/98（31） | 1.142 | 0.285 |
2. 年龄35~39岁者行固定方案和灵活方案的妊娠结局比较
对于年龄35 ~ 39岁者,固定方案组与灵活方案组的妊娠结局各项指标比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见表4。
表4 年龄35 ~ 39岁者行固定方案和灵活方案的妊娠结局比较 |
| 项 目 | 固定方案组（127个周期） | 灵活方案组（30个周期） | t/Z/$\chi ^{2}$值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| Gn总用量（U） | 1 855±513 | 1 882±435 | -0.260 | 0.795 |
| HCG注射日雌二醇水平（pg/ml） | 1 832±923 | 1 683±728 | 0.830 | 0.408 |
| HCG注射日子宫内膜厚度（mm） | 10.29±2.98 | 9.78±2.09 | 0.886 | 0.377 |
| 获卵数（个） | 8（5） | 7（5） | 1.484 | 0.143 |
| 优质胚胎数（个） | 2（3） | 2（2） | -0.642 | 0.521 |
| 临床妊娠率[周期（%）] | 51（40） | 17（57） | 2.694 | 0.101 |
| 种植率[种植胚胎数/移植胚胎数（%）] | 61/237（26） | 21/58（36） | 2.544 | 0.111 |
3. 年龄≥40岁者行固定方案和灵活方案的妊娠结局比较
对于年龄≥40岁者,固定方案组与灵活方案组的妊娠结局各项指标比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见表5。
表5 新鲜周期中年龄≥40岁者行固定方案和灵活方案的妊娠结局比较 |
| 项 目 | 固定方案组（77个周期） | 灵活方案组（34个周期） | t/Z/ $\chi ^{2}$值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| Gn总用量（U） | 2 150±608 | 2 200±659 | -0.388 | 0.699 |
| HCG注射日雌二醇水平（pg/ml） | 1 462（816） | 1 088（774） | 1.686 | 0.092 |
| HCG注射日子宫内膜厚度（mm） | 9.8±3.3 | 9.6±3.0 | 0.756 | 0.451 |
| 获卵数（个） | 6（4） | 5（3） | 1.525 | 0.133 |
| 优质胚胎数（个） | 2.2（1.8） | 1.7（1.6） | 1.466 | 0.152 |
| 临床妊娠率[周期（%）] | 15（19） | 5（15） | 0.364 | 0.546 |
| 种植率[%（种植胚胎数/移植胚胎数）] | 9（14/154） | 8（5/59） | 0.020 | 0.888 |
四、 二元Logistic回归分析结果
为了控制混杂因素,进行了二元Logistic回归分析,纳入了年龄、Gn启动剂量、Gn总用量、HCG注射日子宫内膜厚度、获卵数、移植胚胎数以及方案的选择等因素,结果显示年龄越小、移植胚胎数越多,临床妊娠率越高（P均< 0.05）。在校正了其他因素后,选择固定方案或灵活方案对临床妊娠率无影响（P > 0.05）,见表6。
表6 二元Logistic回归分析结果 |
| 项 目 | B值 | P值 | 校正后OR | 95%CI |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | -0.040 | 0.033 | 0.961 | 0.927 ~ 0.996 |
| Gn启动剂量（U） | -0.005 | 0.182 | 0.995 | 0.988 ~ 1.002 |
| Gn总用量（U） | 0 | 0.260 | 1.000 | 0.999 ~ 1.000 |
| 促排时间（d） | 0.169 | 0.150 | 1.184 | 0.943 ~ 1.487 |
| HCG注射日子宫内膜厚度（mm） | 0.018 | 0.253 | 1.018 | 0.988 ~ 1.049 |
| 获卵数（个） | 0.031 | 0.146 | 1.032 | 0.989 ~ 1.076 |
| 移植胚胎数（个） | 0.563 | 0.012 | 1.756 | 1.167 ~ 2.642 |
| 方案 | 0.172 | 0.466 | 1.188 | 0.755 ~ 1.868 |
讨 论
一般认为,各种促排卵方案的制定必须在保证一定数量的卵泡发育的同时抑制内源性的LH峰。最早用于抑制LH峰的药物是GnRH-a,但其可产生激发（一过性升高）效应,需要等待受体的耗竭和脱敏,还可能过度抑制垂体。在上世纪90年代,GnRH-ant开始在辅助生殖领域用于抑制LH峰的产生[6]。GnRH-ant可以与垂体上的GnRH受体竞争性结合,即时产生抑制LH的作用,与GnRH-a相比具有使用方便、促排卵时间短、无一过性升高效应的优点,且其抑制作用呈剂量依赖性,停药后48 h即解除对垂体的抑制作用,GnRH-ant方案还可以降低OHSS的发生率[7]。然而,关于何时添加GnRH-ant仍存在争议。一项大样本多中心的回顾性研究纳入了27 000个采用GnRH-ant方案的IVF周期,探究添加GnRH-ant的最佳时机,结果显示在第5日或第6日添加GnRH-ant所获得的临床妊娠率是最高的,而当雌二醇水平过低（< 300 pg/ml）或过高（> 1 100 pg/ml）时添加GnRH-ant均会明显降低临床妊娠率[8]。目前GnRH-ant方案主要有固定方案和灵活方案。固定方案即在促排卵第5日或第6日添加GnRH-ant,而灵活方案即当优势卵泡直径≥14 mm或优势卵泡直径≥12 mm且雌二醇>300 pg/ml时添加GnRH-ant。
一项随机对照研究纳入了146个IVF周期,其中72个周期在促排第6日开始添加GnRH-ant,74个周期在优势卵泡直径>14 mm时添加GnRH-ant,其余条件保持一致,观察2组的促排卵效果和临床结局,结果显示2组的获卵数、继续妊娠率、流产率、种植率均相近,且无早发LH峰的发生[2]。有学者对11个比较GnRH-ant固定方案和灵活方案的临床研究进行荟萃分析,其中包括4项随机对照研究,结果表明固定方案组的临床妊娠率较高,尤其是高于灵活方案组中启动第8日才添加GnRH-ant者,但灵活方案组能明显减少Gn和GnRH-ant用量,所有纳入的研究均无早发LH峰的出现,可能与纳入研究的样本量较小有关[9]。本研究显示,固定方案组和灵活方案组的妊娠结局无统计学差异。而二元Logistic回归分析也进一步证实,年龄和移植胚胎数是临床妊娠率的影响因素, 而固定方案和灵活方案的选择并不影响临床妊娠率。
另一方面, LH峰的出现由排卵前优势卵泡分泌的雌二醇正反馈诱发,是促进卵泡最后成熟、恢复卵母细胞减数分裂的关键。但控制性超促排卵是抑制多卵泡发育的过程,超生理水平的雌二醇易诱发过早内源性LH峰的产生。而早发LH峰的出现可抑制颗粒细胞增殖,卵泡闭锁,排卵前卵泡黄素化,影响子宫内膜的容受性,导致周期取消率增加[10]。因此,促排卵过程中抑制内源性LH,防止早发LH峰的发生十分重要。然而,欧湘红等[11]回顾性分析了108例行IVF-ET的高龄患者,比较GnRH-ant固定方案和灵活方案的促排卵效果,结果发现,对于高龄患者,应用GnRH-ant固定方案会导致卵泡中期过低的LH水平,影响卵母细胞和胚胎质量,而灵活方案组GnRH-ant的用量减少、使用时间缩短, 获得更多的优质胚胎,减轻患者经济负担。近年有学者提出要在GnRH-ant固定方案中反向添加LH[12]。本研究显示,虽然灵活方案组的Gn总用量明显减少,但其HCG注射日LH水平、早发LH峰发生率和取卵取消率略高于固定方案。2015年的专家共识也提出GnRH-ant灵活方案可能导致早发LH峰的发生[13]。
本研究中固定方案在增加获卵数、成熟卵子数和优质胚胎数方面优于灵活方案。可能有以下几点原因：第一,本研究为回顾性研究,不可避免存在选择偏倚,而且无法确定因果关系。第二, 一般在临床工作中,若患者本身为慢反应人群,医生则倾向于推后数日再添加GnRH-ant,无形中延长了促排卵时间。而高龄患者往往因卵巢储备低,促排卵过程中容易呈现慢反应, 所以医生倾向于采用灵活方案。虽然本研究中固定方案组和灵活方案组年龄比较差异无统计学意义,但灵活方案组年龄略高。第三,对于年龄≥40岁者,灵活方案组的获卵数、优质胚胎数和种植率略低于固定方案组,可能也正是因为患者本身为慢反应,所以才采用灵活方案。因此还需要更多的随机对照研究确定方案的选择与妊娠结局之间的关系。
综上所述,GnRH-ant固定方案和灵活方案的妊娠结局相近,与灵活方案相比,GnRH-ant固定方案组的促排卵时间减少,获卵数、成熟卵子数和优质胚胎数增加。由于本研究为回顾性研究,因此仍需要前瞻性的随机对照研究来明确方案的选择与妊娠结局的关系。