前列腺炎分为急性和慢性前列腺炎,慢性非细菌性前列腺炎（CNP）是前列腺炎中最常见的类型,占慢性前列腺炎的90%以上[1]。据报道,非细菌性前列腺炎与BPH和男性下尿路症状（LUTS）的发展有关[2]。研究显示,前列腺活组织检查（活检）标本中BPH体积和国际前列腺症状评分（IPSS）有关,且严重的炎症与高IPSS相关[3,4]。前列腺炎症可能是BPH和男性LUTS的重要病因之一。另有研究显示,雌激素通过2种不同的雌激素受体（ER）即ERα和ERβ调节组织炎症[5]。ERβ的抗炎作用也在各种动物疾病模型中发挥作用,如脑脊髓炎、炎症性肠病、膀胱炎和皮肤病。桂枝茯苓丸源于张仲景《金匮要略·妇人妊娠病脉并治》,由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍组成,原为针对妊娠期妇女化淤的方剂。近年研究显示,其应用己不限于妇科疾病,对治疗CNP同样有效[6]。因此,本研究利用前列腺内注射甲醛诱导CNP大鼠模型来研究桂枝茯苓丸是否可以通过调节ERβ减轻膀胱过度活动,现报告如下。
材料与方法
一、实验动物
SPF级健康成年雄性SD大鼠15只,8周龄,体质量200 ~ 250 g,由温州医科大学实验动物中心提供[实验动物许可证 SCXK（浙）2015-0001],于恒定室温下,12 h循环照明的环境中自适应饲养7 d,期间自由摄食与饮水。本研究所有的实验操作均符合中国实验动物管理规定,研究方案经温州医科大学实验动物管理和伦理委员会批准。
二、主要试剂及仪器
主要试剂包括：桂枝茯苓丸（成都九芝堂金鼎药业有限公司）,DAB显色液（北京中杉金桥生物技术有限公司）,0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS,北京中杉金桥生物技术有限公司）,S-P免疫组织化学染色（免疫组化）检测试剂（北京中杉金桥公司）。主要仪器包括：Leica CM2500显微成像系统,OlympusCX21显微镜,SHIMADZU电子分析天平（万分一）,莱卡石蜡切片机,匀浆器（江苏金坛市晶玻实验仪器厂）,旋涡混合器（北京北德科学器材有限公司）,Hitachi-CR20B2高速冷冻离心机, GZX-9070电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。
三、方 法
1. 分 组
经过适应性饲养后将大鼠分生理盐水组、模型组、药物治疗组,每组各5只。生理盐水组大鼠前列腺的双侧腹叶予50 μl生理盐水注射。模型组及药物治疗组大鼠前列腺的双侧腹叶予50 μl的5%甲醛溶液注射诱导前列腺炎症[7]。药物治疗组大鼠从甲醛注射前2 d开始,持续30 d予桂枝茯苓丸及生理盐水制成的混悬液0.5 g /（kg·d）灌胃,模型组大鼠在相应时间予等体积生理盐水灌胃。
2. 膀胱测压
在大鼠前列腺内注射50 μl 5%甲醛溶液或生理盐水28 d后行膀胱测压。测定前2 d用异氟烷麻醉大鼠,将PE-50聚乙烯导管从膀胱壁插入膀胱中,并且在膀胱测压当日将导管通过三通旋塞连接到压力传感器和注射泵上,以0.05 ml/min的速度将生理盐水通过注射泵注入膀胱内,并在Power-LabTM数据采集分析系统上采集数据记录膀胱内压。大鼠适应环境至少2 h后,分别记录3次排尿周期以评估排尿间隔（VI）、最大排尿压（MVP）和无排尿性收缩次数（NVC）。在3次排尿循环之后,停止注射生理盐水并撤回膀胱内导管,随后通过腹壁手动压缩膀胱测量排空后残余尿量（RV）。
3. 组织病理学检查
膀胱测压后,用颈椎脱臼法处死大鼠,下腹部正中切口,直达腹腔,取前列腺腹叶和膀胱组织进行组织学分析,用10%甲醛溶液固定24 h,石蜡包埋,切片,苏木素-伊红（HE）染色评估炎症程度。前列腺的其余部分用于免疫组化。将石蜡切片脱蜡、梯度乙醇水化,在105 ℃下用高压灭菌器以10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液修复抗原,冷却后PBS冲洗,3%过氧化氢中孵育10 min消除过氧化物酶活性,蒸馏水和PBS冲洗。滴加10%正常山羊血清封闭30 min。滴加ERβ抗体在室温下孵育1 h。PBS洗涤,滴加HRP标记的聚合物抗兔抗体温育30 min。PBS洗涤,用DAB显色液显色2 ~ 5 min,苏木素复染。
4. 实时荧光定量PCR
处死大鼠后打开腹腔,取前列腺腹侧叶和一部分膀胱黏膜组织至新的1.5 ml EP管中,用玻璃棒研磨,加入Trizol 1 ml充分振荡混匀,加入氯仿0.2 ml,盖紧后用力摇15 s,15 ~ 30 ℃孵育2 ~ 3 min,4 ℃ 12 000×g 离心15 min,取上清液,根据说明书使用Trizol试剂提取总RNA;使用ThermoScript RT-PCR系统将总RNA（1 mg）合成为模板DNA。引物分别为ERβ（NM_012754）、ERα（NM_012689）、TNF-α（NM_012675）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS,XM_003750865）、环氧酶2（COX2,NM_017008）、三磷酸腺苷受体（P2X2,NM_207608）、瞬时受体电位通道A1（TRPA1,XM_008769306）、神经生长因子（NGF,NM_001277055）和内参基因GAPDH（NM_017008）。其中引物ERβ、ERα、TNF-α、COX2、NGF和GAPDH由QIAGEN（QuantiTect Primers）预先设计和验证,其他引物由Primer 3软件设计（表1）。PCR反应体系50 μl,反应条件为：94 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 60 s,最后72℃延伸7 min,共30个循环。SYBR Green法荧光定量PCR分析各基因的表达并利用2-ΔΔCT法分析相应的数据,取每个靶基因与GAPDH的表达比值为相对表达的结果。
表1 Primer 3设计合成的引物序列 |
| 基因名称 | 引物序列（5’→3’） | 编号 | 片段长度（bp） |
|---|---|---|---|
| iNOS | 上游AGACGCACAGGCAGAGGT | XM_003750865 | 127 |
| 下游AGGCACACGCAATGATGG | |||
| TRPA1 | 上游ATCAGGAGACCCTGCTTCAC | XM_008769306 | 86 |
| 下游GTTGATGTCTGCTCCCACTG | |||
| P2X2 | 上游GCATCATCACCAGGATCGAG | NM_207608 | 181 |
| 下游GTCTTGGAGTCCCCATGGTA |
四、统计学处理
使用SPSS 17.0分析数据。计量数据以$\bar{x}±s$表示,多组间比较采用方差分析,多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、3组大鼠的膀胱测压结果比较
在前列腺内注射50 μl 5%甲醛溶液或生理盐水28 d后3组大鼠的排尿间隔（F = 23.895,P < 0.001）、每排尿周期无排尿性收缩次数（F = 38.224,P < 0.001）、最大排尿压（F = 24.629,P< 0.001）、残余尿量（F = 10.236,P = 0.002）比较差异有统计学意义。与生理盐水组大鼠相比,模型组大鼠排尿间隔较短、每周期无排尿性收缩次数较多、最大排尿压较低、残余尿量较少（P均> 0.05）,药物治疗组大鼠上述指标均较模型组改善（P均< 0.05）,见图1。
二、3组大鼠的组织病理学比较
三、3组大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和TRPA1 mRNA相对表达比较
生理盐水组、模型组、药物治疗组大鼠膀胱黏膜中NGF（F = 43.648,P < 0.001）、P2X2（F = 37.017,P< 0.001）和TRPA1（F = 34.572,P < 0.001）的mRNA相对表达差异均有统计学意义,模型组大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和TRPA1的mRNA相对表达均高于生理盐水组（P均< 0.05）,药物治疗组大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和TRPA1的mRNA相对表达均低于模型组（P均< 0.05）,见图3。
四、3组大鼠前列腺腹叶中TNF-α、iNOS、COX2、ERα、ERβ mRNA相对表达比较
3组大鼠前列腺腹叶中TNF-α（F = 18.580,P < 0.001）、iNOS（F = 15.690,P < 0.001）、COX2（F = 16.345,P = 0.004）、ERα（F = 26.844,P < 0.001）、ERβ（F = 20.657,P < 0.001）mRNA相对表达和ERβ/ERα（F = 12.062,P = 0.001）比较差异均有统计学意义。与生理盐水组相比,模型组大鼠前列腺腹叶中TNF-α、iNOS、COX2、ERα、ERβ的mRNA相对表达均较高（P均< 0.05）,而药物治疗组的上述基因mRNA相对表达均低于模型组（P < 0.05）。模型组大鼠ERβ mRNA相对表达低于生理盐水组,ERα mRNA相对表达高于生理盐水组（P均< 0.05）,而药物治疗组大鼠ERβ mRNA相对表达、ERβ/ERα高于模型组,ERα mRNA相对表达低于模型组（P均< 0.05）,见图4。
五、3组大鼠的免疫组化
讨 论
桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍组成,主药桂枝辛甘而温、温通经脉,以除淤滞,辅药桃仁味苦甘平,活血化淤,丹皮、白芍味苦微寒,既能活血散淤,又可凉血以清淤热,白芍兼能缓急止痛。茯苓甘淡性平,利水渗湿以祛痰,并能健脾益气。该方寒温并用,温通祛淤而无耗伤阴血之弊,祛邪以固本,下淤不伤正。该药原用于妇科,在子宫肌瘤和卵巢囊肿等有较好的治疗效果,也有助女性调理月经。近年多项研究显示,其应用己不限于妇科疾病,凡辨证属于血淤湿滞者的各科疾病,均可加减用之且有效,这也是中医学中“异病同治”的治法和优势。有研究报道,桂枝茯苓丸可降低血清雌激素受体（ER）水平,但存在研究的样本尚少,未能阐明治疗机制[8]。
本研究未对前列腺炎症表型进行定量分析,包括前列腺炎或桂枝茯苓丸治疗后异常腺泡的发生率,而主要关注膀胱表型,如膀胱过度活动和前列腺炎症后膀胱的分子变化。因此,需要进一步研究验证ER介导的前列腺炎调节机制。
总之,炎症相关基因表达的增加和ERβ/ERα的降低可能导致动物模型中CNP和膀胱过度活动的发生。而桂枝茯苓丸给药治疗可以升高ERβ/ERα,并抑制膀胱过度活动和前列腺炎症。因此,ERβ刺激可能成为治疗前列腺炎症和BPH患者中刺激性膀胱症的治疗策略。