正畸牙移动（OTM）的基础是牙槽骨的适应性改建,即压力侧主要发生骨吸收,张力侧主要发生骨形成[1]。OTM具体的调控机制一直是正畸研究的热门方向。近年来,不少文献报道周围神经系统与骨改建密切相关[2]。通常交感神经更多地参与破骨过程,而感觉神经则与骨形成关系更密切。有学者使用高剂量辣椒素（150 mg/kg）去除感觉神经后,大鼠肱骨近端的骨小梁体积和力学性能（强度、硬度等）下降[3]。另有学者观察到注射辣椒素8周后,大鼠胫骨的骨小梁体积减少[4]。机械刺激能够上调神经生长因子（NGF）和感觉神经中的NGF-TrkA信号,促进骨形成[5]。在OTM期间,牙周膜中降钙素基因相关肽（CGRP）的表达增加[6]。骨髓间充质干细胞和成骨细胞也表达CGRP和P物质的受体[2, 7]。然而,感觉神经调节骨改建的具体机制仍未被阐明。Wnt信号通路在成骨分化和骨形成中均起重要作用[8]。骨髓间充质干细胞转染脂联素后,β-连环蛋白（β-catenin）和细胞周期蛋白（cyclinD1）等Wnt/β-catenin信号通路相关的分子表达明显上调,成骨分化和骨形成能力增强[9]。Wnt-16缺陷的小鼠则表现出低皮质骨厚度,高皮质孔隙率和自发性骨折[10]。机械力刺激能激活干细胞中的Wnt信号通路并促进成骨分化。给予牙周膜干细胞静压力刺激1 h后,Wnt/β-catenin信号通路激活,成骨分化能力增加[11]。在OTM期间,外周感觉神经标志物CGRP在牙周膜中高度表达[6]。外周感觉神经可能通过Wnt信号通路调控OTM骨形成,但其中具体机制仍有待阐明。本研究初步探讨了外周感觉和Wnt信号通路在OTM骨形成过程中的作用,为OTM的具体机制提供一定的理论基础。
材料与方法
一、OTM模型和去感觉神经模型的建立
本实验动物购于中山大学东校区实验动物生产中心。将36只8周龄的雄性无特定病原体（SPF）级SD大鼠（200 ~ 220 g） 按随机数字表法分成4组：不注射辣椒素+不进行牙移动组（对照组）、不注射辣椒素+牙移动组（牙移动组）、注射辣椒素+不进行牙移动组（去神经组）、注射辣椒素+牙移动组（去神经+牙移动组）,每组各9只大鼠。每组其中3只大鼠用于实时荧光定量PCR检测,其余用于免疫组织化学染色（免疫组化）检测。根据Ding等[3]的方法建立去感觉神经模型。辣椒素（Sigma,美国）溶于10%吐温80+10%无水乙醇+80%生理盐水中。对照组及牙移动组大鼠注射10%吐温80+10%无水乙醇+80%生理盐水。其他2组大鼠建立去神经模型：每日注射辣椒素前,从上午10时至下午4时予禁水（防止辣椒素注射的并发症）,将辣椒素溶液注射到大鼠后颈部皮下,并将针头留在皮下60 s以防止渗漏。连续注射3 d,每日剂量分别为30、50、70 mg/kg。最后一次注射的7 d后,参照An等[12]的方法,在牙移动组、去神经+牙移动组大鼠建立OTM模型：用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉大鼠。将镍钛弹簧安置于右上颌第一磨牙和上颌中切牙之间,并用不锈钢结扎线固定,施加50 g正畸力。9 d后处死所有大鼠,取材用于逆转录定量 PCR（qRT-PCR）和免疫组化检测。
二、qRT-PCR检测
在OTM 9 d后取大鼠右上颌第一磨牙及其周围牙槽骨,在液氮中研磨成粉末。使用Eastep® Super Total RNA Extraction试剂盒（Promega, 中国）提取总RNA,使用PrimeScriptTM RT Master Mix （Takara, 日本） 和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ （Takara, 日本）进行逆转录和荧光定量,引物设计如表1所示。
表 1 qRT-PCR 引物序列 |
| 基 因 | 引 物 | 产物 长度 |
|---|---|---|
| Wnt5a | 正向5’-CCACAAGAGACAGCTAGGGC-3’ | 305 bp |
| 反向5’-AGAGCATGAGCCTTTTCGGT-3’ | ||
| Wnt10b | 正向5’-CCGTGAGTTAGGTCGAGCAG-3’ | 202 bp |
| 反向5’-GTGGGGAAACTGTGTGGAGT-3’ |
三、免疫组化
将扫描完的样品用10%乙二胺四乙酸（EDTA,赛维尔,中国）脱钙2个月,每3 d更换一次脱钙液。脱钙完成后,沿着矢状面进行石蜡切片,以获得完整的牙根和周围的牙周组织,切片厚度为4 μm。用EDTA（百奥斯生物,中国）进行抗原修复,3%H2O2孵育20 min,10%山羊血清封闭20 min,一抗4℃孵育过夜。一抗如下：Wnt5a（Affinity,美国;1∶300）、骨钙素（OCN,Arigo,中国;1∶1000）。使用HRP-山羊抗大鼠IgG二抗（antGene,中国）和Dako REALTM EnVisionTM Detection System试剂盒（DAKO,丹麦）进行二氨联苯胺（DAB）染色。使用NanoZoomer S360（Hamamatsu,日本）扫描切片。使用Image Pro Plus 6.0测量右上颌第一磨牙根远中牙周膜的平均光密度。
四、统计学处理
实验重复3次,实验数据以 $\bar{x} \pm s$ 表示。使用SPSS 23.0进行统计分析。组间比较使用析因设计资料的方差分析,交互效应有统计学意义时,行单独效应分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、去感觉神经抑制OTM诱导的Wnt5a的表达
1. qRT-PCR结果
牙移动组大鼠进行了9 d的OTM后,其牙槽骨中Wnt5a mRNA表达上调（图1A）。但去神经+牙移动组大鼠处理9 d后Wnt5a表达无明显变化,表明Wnt5a mRNA的表达受到感觉神经的影响。析因设计资料方差分析显示,两因素间的交互效应有统计学意义（F = 17.197,P = 0.002）,因此分析单独效应,结果显示牙移动组大鼠牙槽骨中Wnt5a mRNA表达高于去神经+牙移动组（t = 6.835,P < 0.001）;去神经组大鼠Wnt5a mRNA表达与去神经+牙移动组大鼠比较差异无统计学意义（t = 1.237,P = 0.247）。无论是否去神经,OTM后Wnt10b mRNA的表达均上调（图1B）,表明Wnt10b的表达不受感觉神经的影响,析因设计资料方差分析结果表明,OTM的主效应有统计学意义,OTM大鼠Wnt10b mRNA表达高于无OTM大鼠（F = 22.471,P < 0.001）;去神经的主效应无统计学意义（F = 1.317,P = 0.272）;两因素间的交互效应无统计学意义（F= 0.001,P = 0.975）。
2. 免疫组化检测结果
牙移动组大鼠的张力侧牙周膜中Wnt5a 蛋白表达高于对照组;但去神经+牙移动组大鼠的Wnt5a蛋白表达无上调。两因素间的交互效应有统计学意义（F = 6.549,P = 0.018）,因此分析单独效应,结果显示牙移动组大鼠张力侧牙周膜中Wnt5a蛋白表达高于去神经+牙移动组大鼠（t = 4.548,P < 0.001）;去神经组大鼠Wnt5a蛋白表达与去神经+牙移动组大鼠比较差异无统计学意义（t = 0.123,P = 0.903）,见图2。
二、去感觉神经抑制张力侧牙周膜内成骨标志物OCN的表达
牙移动组大鼠张力侧牙周膜中OCN的表达高于对照组,表明张力侧成骨活动增强。而去神经+牙移动组大鼠牙周膜中OCN的表达无明显变化。两因素间的交互效应有统计学意义（F = 6.669,P = 0.016）,因此分析单独效应,结果显示牙移动组大鼠张力侧牙周膜中OCN蛋白表达高于去神经+牙移动组大鼠（t = 3.721,P = 0.001）;去神经组大鼠OCN蛋白表达与去神经+牙移动组大鼠比较差异无统计学意义（t = 0.462,P = 0.648）,见图3。
讨 论
本研究初步探讨了外周感觉神经和Wnt信号通路在OTM中的作用,结果显示OTM过程中Wnt5a表达上调,但去除感觉神经后Wnt5a表达受到抑制,表明感觉神经可能通过Wnt5a调控OTM骨改建过程。
文献报道,感觉神经对骨改建起着重要作用,但是其分子机制尚不明确[2]。本研究显示,去除感觉神经以后,OTM不能上调Wnt5a的表达,且牙移动和去感觉神经之间存在交互效应,提示感觉神经可能通过Wnt5a调控OTM的骨改建过程。但骨改建过程中感觉神经如何调控Wnt5a的表达尚未明确。CGRP和P物质都是感觉神经重要的分泌物,它们都具有促进成骨分化和骨形成的作用[2]。用CGRP处理骨髓间充质干细胞后,Wnt信号通路相关分子发生明显上调[8]。10-10 ~ 10-8 mol/L的P物质可以促进MC3T3-E1细胞的成骨分化,这种促进作用可被DKK1抑制,表明P物质通过Wnt信号通路促进成骨分化[15]。以上结果提示感觉神经有可能通过CGRP和P物质调控Wnt5a的表达,我们将在日后的工作中进一步研究。
另外,本研究还发现去除感觉神经会影响张力侧成骨标志物OCN的表达水平,去神经后牙周膜张力侧OCN的表达不再随着OTM的进行而上调,但Wnt5a如何调控骨的形成也有待于进一步研究。近年文献报道,Wnt5a在成骨过程中可以激活经典的Wnt/β-catenin信号通路。Wnt5a可能通过Wnt/β-catenin调控成骨过程[16]。
综上所述,外周感觉神经可能通过Wnt5a调控OTM过程中的骨改建活动。本研究丰富了正畸的基础理论,为快速安全地进行正畸治疗提供了研究方向,有望减少长时间正畸治疗带来的不良反应[17]。