类风湿关节炎（RA）是一种慢性、全身性自身免疫性疾病,以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现。虽然RA的确切发病机制尚未明确,但既往研究显示固有免疫的激活在该病的发病中起着重要作用[1]。固有免疫系统是机体抵抗病原微生物和内在损伤组织入侵的第一道防线,模式识别受体（PRR）是固有免疫系统中的重要成员,其可以识别病原相关分子模式（PAMP）和损害相关分子模式（DAMP）产生相应的对抗病原微生物及损害分子的固有免疫反应。 PRR主要包括Toll样受体（TLR）和细胞内核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）蛋白家族中的NOD样受体（NLRs）。NOD1和NOD2是NLR中最为重要且研究较多的受体[2,3]。既往研究显示,NOD1和NOD2激活后可导致多条信号通路的激活（包括NF-κB及MAPK通路）,进而释放多种促炎因子,参与自噬过程;此外其还与TLR有交叉协同作用[4]。近年有研究探讨了NOD1和NOD2在RA患者的滑膜组织及成纤维样滑膜细胞（FLS）中的表达,发现其可激活MAPK信号通路,并进一步促进促炎因子的释放[5]。Vieira（2012年）进行的动物实验发现NOD2可能参与了RA的炎症机制,其信号通路可能引发了局部关节的免疫炎症反应[8]。本研究旨在初步探讨NOD1、NOD2在RA患者的外周血单核细胞（PBMC）中的表达水平及其可能发挥的功能,现报告如下。
对象与方法
一、研究对象
选择2018年6月至12月在我院住院的40例RA初治患者（RA组）、40例骨关节炎（OA）初治患者（OA组）及40名健康志愿者（对照组）。RA组纳入标准：①年龄18 ~ 70岁;②符合 1987年或2010年美国风湿病学会（ACR）的RA诊断分类标准;③患者的28处关节疾病活动度评估（DAS28） ≥4.0。OA组纳入标准：①年龄18 ~ 70岁;②符合2007年版的OA诊治指南相关标准。对照组纳入标准：年龄18 ~ 70岁,无风湿性疾病或相关家族史。2组的排除标准：①处于妊娠、分娩及哺乳期的女性患者;②合并严重感染者;③合并恶性肿瘤者;④合并其他自身免疫性疾病;⑤入组前曾使用改善病情抗风湿药（DMARD）、生物制剂及糖皮质激素治疗。所有入选者均已签署知情同意书,研究方案的设计及实施均符合相关伦理要求。
二、方 法
1. PBMC的分离及培养
采集入选对象晨起空腹外周血8 ml置于肝素钠抗凝管,轻轻混匀,将混合后的血样取4 ml贴着管壁缓慢转移至已加入4 ml淋巴细胞分离液的离心管内,注意保持液面平整;调整离心机温度24℃,以4000转/分离心10 min。吸取离心管中间层云雾状液体转移至已事先加入4 ml生理盐水的离心管内,调整离心机温度24℃,以4000转/分离心5 min;弃上清液,加生理盐水4 ml再次相同条件下离心5 min。离心后弃上清液,离心管底部沉淀物即为PBMC。随机抽取10例RA患者、10例OA患者及10名健康志愿者的PBMC置于胎牛血清培养,并加入胞壁酰二肽（MDP）激活NOD2。
2. NOD1和NOD2 mRNA水平检测
采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法提取3组PBMC的总RNA,加入Trizol试剂 （Life Sciences, 美国）提取RNA。使用DNA/RNA浓度测定仪测定提取的RNA含量,当测量标本的260 nm 和280 nm光密度比值位于1.8左右时,方可进行后续实验。根据测量结果将RNA浓度稀释调整至约200 μg/μl,再次测量得到准确浓度后通过20 μl的反应体系（SYBR Green qPCR法）进行RNA的逆转录反应获得cDNA片段。应用7500 Fast Real Time PCR System,采用20 μl的扩增体系进行Real Time PCR反应,引物序列如下：GAPDH 正向5’-ATCACCATCTTCCAGGAG-3’、反向5’-ATGGACTGTGGTCATGAG-3’, NOD1正向5’-CAGCACTTTCCCATGTATTGAT-3’、反向5’-T-CAAATCCCACACTGCACA-3’,NOD2正向5’-GG-TTGATGCCTGTGAACTGAA-3’、反向5’-AAA-TGAAATGGAACTGCCTCTT-3’。反应条件：预变性95 ℃ 30 s,然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s循环40次,最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95℃ 15 s。实验重复3次,GAPDH作为对照基因,计算目的基因NOD1、NOD2的2-△△Ct值,比较3组间差异。
3. 上清液细胞因子水平的检测
在RPMI培养液中培养RA患者、OA患者及健康志愿者的PBMC（浓度约1×106/L）,各加入MDP（InvivoGen,美国）、MDP Control（InvivoGen,美国）培养24 h。取其上清液,通过ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的水平,上述检测试剂盒均为美国R&D公司产品。
三、统计学处理
采用SPSS 17.0进行统计分析。计量资料以$\bar{x} \pm s$表示,多组比较采用单因素方差分析,多重比较采用LSD-t法。计数资料以例（%）表示,组间比较采用2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、RA组患者的基本情况及其与OA组及对照组的性别构成、年龄比较
RA组男12例、女28例,年龄（45.4±8.7）岁,OA组男9例、女31例,年龄（47.8±5.7）岁,对照组男10例、女30例,年龄（46.6±6.8）岁,3组的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。RA患者的病程为（3.2±1.4）年,DAS28为（5.2±0.8）分,RF（78.5±24.8）kU/L,抗环瓜氨酸抗体（CCP）阳性36例（90%）,ESR（85.4±18.2）mm/h,CRP（73.5±25.4）mg/L。
二、RA组、OA组与对照组PBMC的NOD1、NOD2 mRNA表达水平比较
3组NOD1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（F = 0.148,P = 0.863）。3组的NOD2 mRNA表达水平比较差异有统计学意义（F = 245.3,P < 0.001）,多重比较显示RA组的NOD2 mRNA表达水平高于其他2组（P均< 0.001）,见图1。
三、NOD2激活后3组PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比较
讨 论
虽然有关RA确切的发病机制尚不清楚,但是既往研究表明固有免疫细胞中的PRR在其发病中起着重要作用,如单核细胞在RA的滑膜增生及促炎细胞因子产生中发挥着重要的作用。本研究初步探讨了未受DMARD作用影响的RA患者与OA患者及健康志愿者的外周血PBMC中与固有免疫相关的NLR家族成员NOD1及NOD2 mRNA表达水平差异。研究显示,RA组PBMC中NOD2 mRNA表达水平高于其他2组,而NOD1 mRNA表达水平在3组PBMC中比较差异无统计学意义。既往国外也有相似结论的研究,但是该项研究是在已正规治疗的RA患者中进行的,并未排除服用甲氨蝶呤等DMARD的因素[5]。本研究首次探讨了初治RA患者中NLR的表达,排除了药物治疗的影响因素。此外,有部分研究探讨了NOD2在RA滑膜组织中的表达,发现其在RA的滑膜细胞中表达上调[5,6]。上述研究均是在组织的固有细胞进行的,而本研究是在PBMC中进行。通过体外培养3组PBMC,使用MDP激活NOD2后,研究显示RA患者的PBMC释放了大量的炎性细胞因子,其中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均比其他2组升高,OA组与对照组释放的细胞因子水平比较差异均无统计学意义。该结果提示NOD2在RA的关节炎发病机制中可能发挥着某些致炎作用。近年Kim等[6]研究也显示NOD2基因和蛋白表达水平在RA患者中表达较OA患者明显增加,而RA患者成纤维样滑膜细胞中NOD2基因的下调可减少促炎因子的生成,此外其下调还能降低NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平。因此,本研究针对RA患者PBMC中NOD2的研究发现与既往有关NOD2在RA局部滑膜细胞中的研究发现相似,均提示NOD2可能在RA发病机制的固有免疫中充当着重要角色。但是,目前有关RA发病中激活NOD2的成分尚不明确,此外其在关节及外周血中具体激活通路及致病机制研究尚少,仍需日后研究进行深入探讨。
综上所述,NLRs中NOD2在RA的PBMC中表达较OA及健康志愿者升高,其激活可诱发IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子释放,这提示NOD2可能参与RA的发病过程,但其具体分子机制仍需进一步深入研究。