高浓度氧疗对危重症患者的危害已经引起了国内外呼吸危重症领域的关注,但国内相关研究仍然较少。笔者前期研究发现高氧可以引起肺上皮细胞凋亡[1]。有研究显示,Wnt-1诱导信号通路蛋白3/调节蛋白6（WISP-3/CCN6）作为一种信号传导因子在高氧诱导的肺上皮细胞凋亡中具有保护性作用,但其机制仍然不清楚。本文将在前期研究的基础上进一步探究WISP-3/CCN6在高氧诱导肺上皮细胞凋亡中的作用机制,为未来防治高氧性肺损伤提供基础依据。
材料与方法
一、细胞培养
人肺上皮细胞株（Beas-2B细胞）购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃含5%CO2细胞培养箱中进行培养。
二、高氧模型的建立
三、WISP-3/CCN6质粒及siRNA转染
通过质粒转染和小干扰RNA（siRNA）技术实现对Beas-2B细胞中WISP-3/CCN6基因的过表达及沉默,选用Lipofectamine 2000转染试剂盒,购自美国Invitrogen公司,详细步骤参考试剂盒说明书。
四、蛋白免疫印迹检测
分别把沉默或过表达WISP-3/CCN6基因的Beas-2B细胞置于高氧中培养0、24、48 h,以空气环境为对照（control）。提取各组细胞蛋白,蛋白免疫印迹法检测半胱氨酸蛋白酶（Caspase）途径凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-3和活化片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3以及cleaved-多聚ADP核糖聚合酶（PARP）表达量。WISP-3/CCN6、β-actin抗体购自美国Sigma公司。采用Image J软件对结果进行灰度分析。
五、流式细胞仪检测Caspase-8蛋白活性
采用美国BD公司的Caspase-8蛋白活性检测试剂盒和BD公司的流式细胞仪检测空气环境及高氧刺激0、48 h时WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中Caspase-8的活性。
六、免疫荧光-激光共聚焦试验
为了进一步验证WISP-3/CCN6在高氧刺激肺上皮细胞的作用方式,利用免疫荧光-激光共聚焦和免疫共沉淀法检测WISP-3/CCN6蛋白与细胞内凋亡关键蛋白的结合变化。其中免疫荧光-激光共聚焦采用美国Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗体、美国Santa Cruz公司的抗Caspase-8抗体和德国Leica公司的激光扫描共聚焦显微镜进行检测。步骤为：①24孔板中放置圆形玻片,将Beas-2B细胞接种于玻片上;②放入37℃、5%CO2培养箱中培养到细胞密度约50% ~ 60%,把细胞分别置于高氧（95%O2和5%CO2）和空气中处理24 h;③用镊子轻轻取出玻片置于操作台上,趁玻片未干时向玻片滴入磷酸盐缓冲液（PBS）,然后负压吸干,洗涤3次;④在玻璃片上滴入4%多聚甲醛,固定30 min后,负压吸干,固定细胞;⑤滴入0.5% Triton-X-100覆盖整个玻片,室温放置1 h（细胞膜打孔）;⑥然后用PBS洗涤3次,滴入5%牛血清白蛋白,室温放置2 h;⑦把玻片放回24孔板,加入1∶100的一抗（Caspase-8抗体和WISP-3/CCN6抗体）4 ℃过夜孵育;⑧次日取出,用PBS洗涤3次后加入荧光抗体（红色为Caspase-8抗体,绿色为WISP-3/CCN6抗体）,避光孵育10 min;⑨取出玻片,自然晾干后倒扣于载玻片上,周围用指甲油封边。最后在激光共聚焦显微镜下观察空气环境和高氧环境下Caspase-8与WISP-3/CCN6的结合情况。
七、免疫共沉淀试验
采用美国Abcam公司的细胞裂解液RIPA缓冲液、美国Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗体进行检测。步骤为：①把Beas-2B细胞接种于6孔板,放入37℃、5%CO2培养箱中培养到细胞密度约50% ~ 60%,把细胞分别置于高氧（95%O2和5%CO2）、空气中处理4 h;②取出细胞置于冰上,用预冷的PBS溶液洗涤细胞2次后,加入细胞裂解液RIPA buffer（含蛋白酶抑制剂）,冰上裂解30 min;③4℃,18 000转/分离心30 min后,把上清液转移到新的EP管,取少量样品以备蛋白免疫印迹分析;④在样品中加入1 μl的兴趣蛋白抗体,4℃摇床缓慢摇晃孵育过夜;⑤次日取10 μl的Protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3000转/分离心3 min;⑥将预处理过的10 μl的Protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的样品中,4℃摇床缓慢摇晃孵育2 ~ 4 h,使抗体与protein A琼脂糖珠充分偶联;⑦4℃,3000转/分<br/>离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底,将上清小心吸去,琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗涤3 ~ 4次,洗涤时用手指轻弹;⑧最后加入15 μl的2倍SDS 上样缓冲液,沸水煮5 min,免疫印迹检测目的蛋白。本研究的兴趣蛋白为WISP-3/CCN6,目的蛋白为Caspase-8。
八、统计学处理
采用SPSS 22.0分析结果,计量资料采用$\bar{x} \pm s $表示,组间比较采用方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义,两两比较采用Bonferroni法,即P < 0.05/3 = 0.017为差异有统计学意义。
结 果
一、环境对WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中Caspase途径凋亡相关蛋白的影响
无论是高氧刺激还是空气环境下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表达量均无明显变化（P均> 0.05）。空气环境下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中cleaved Caspase-8和cleaved Caspase-3蛋白表达量均无变化（P均> 0.05）。高氧刺激下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中cleaved Caspase-8蛋白表达量在24 h和48 h升高（总体比较F = 13.590、P = 0.006,与0 h比较P均< 0.017）,cleaved Caspase-3仅在48 h表达上调（总体比较F = 86.24、 P < 0.001,与0 h和24 h比较P均< 0.017）。WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中cleaved PARP表达量在高氧刺激（F = 728.90,P < 0.001）及空气环境（F = 39.19,P < 0.001）24 h和48 h均升高（与0 h比较,P均< 0.017）,高氧刺激下cleaved PARP表达量在WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中升高趋势较空气环境更明显（与24 h比较,P < 0.017）,见图1A ~ C。高氧刺激48 h下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中的Caspase-8活性比0 h时升高,见图1D。
图1 环境对低表达WISP-3/CCN6的Beas-2B细胞中Caspase途径凋亡相关蛋白的影响A：高氧刺激下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中cleaved Caspase-8蛋白量表达增加;B：高氧刺激下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中cleaved Caspase-3蛋白表达量增加;C：高氧刺激及空气环境下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中cleaved PARP蛋白表达量均增加;D：高氧刺激48 h, WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B细胞中Caspase-8活性增加;与0 h时相比,*P < 0.017,与24 h时相比,# P < 0.017 |
二、环境对WISP-3/CCN6过表达的Beas-2B细胞中Caspase途径凋亡相关蛋白的影响
无论是高氧刺激还是空气环境下,WISP-3/CCN6过表达的Beas-2B细胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表达量均无明显变化（P均> 0.05）。空气环境下,WISP-3/CCN6过表达的Beas-2B细胞中cleaved Caspase-3蛋白表达量在48 h时升高（总体比较F = 202.55、 P < 0.001,与0 h和24 h比较P均< 0.017,cleaved PARP蛋白表达量随时间延长而升高（总体比较F = 155.53、P < 0.001,3个时间点两两比较P均<0.017）。高氧刺激下,WISP-3/CCN6过表达的Beas-2B细胞中cleaved Caspase-8随时间延长而均减少（总体比较F = 21.79、P = 0.002,3个时间点两两比较P均< 0.017）,cleaved Caspase-3 （F = 105.10,P < 0.001）和cleaved PARP（F = 320.00,P < 0.001）蛋白表达量在24 h比0 h升高,48 h时均下降（3个时间点两两比较P均< 0.017）,见图2。
三、环境对肺上皮细胞中WISP-3/CCN6和Caspase-8蛋白的相互作用影响
讨 论
高氧诱导肺上皮细胞凋亡的机制是异常复杂的,其确切的机制仍然不清楚。在凋亡通路中,Caspase家族发挥重要的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效应因子,控制下游的凋亡共同通路,它的活化标志着凋亡进入不可逆的阶段,因此Caspase-3及其活性片段也被称为凋亡的生物标志物[4]。
本研究中,肺上皮细胞中WISP-3/CCN6沉默后再接受高氧刺激48 h,细胞的cleaved Caspase-3活性片段表达增加,表明沉默WISP-3/CCN6可以促进Caspase-3的激活。Caspase-3是凋亡外源性和内源性途径的共同效应蛋白,它的激活可以进一步活化下游的凋亡因子,如PARP[5,6,7]。多种凋亡刺激因子可以启动Caspase-3活化,Caspase-3蛋白酶原被切割成有活性的片段cleaved Caspase-3,活化的Caspase-3又进一步作用于下游的不同底物,导致蛋白酶级联反应,最终引起细胞凋亡。为了进一步验证WISP-3/CCN6与Caspase-3的关系,本研究在Beas-2B细胞中过表达WISP-3/CCN6,与0 h时相比,过表达WISP-3/CCN6的细胞在高氧刺激下,Caspase-3蛋白表达量无明显变化,cleaved Caspase-3的蛋白表达量先升高,后下降。因此,WISP-3/CCN6可能控制着Caspase-3的活化,进而调控高氧诱导的肺上皮细胞凋亡。
要验证WISP-3/CCN6通过Caspase-3调控细胞凋亡,仍需要进一步验证WISP-3/CCN6与其下游凋亡效应因子的关系。本研究中Beas-2B细胞沉默和过表达WISP-3/CCN6基因后再接受高氧刺激48 h,结果显示沉默WISP-3/CCN6的肺上皮细胞中 cleaved PARP蛋白表达量增加,而WISP-3/CCN6过表达的肺上皮细胞中的cleaved PARP蛋白表达量先升高,后随时间延长下降,也就是说,WISP-3/CCN6可能影响着PARP的活化。WISP-3/CCN6对肺上皮细胞中Caspase-3和PARP活化的影响是同向的。那么在Caspase-3上游,凋亡启动蛋白是否也与WISP-3/CCN6有联系呢?
Caspase-3和Caspase-8同属于Caspase家族,在细胞凋亡的外源性途径中,Caspase-8是关键的启动型蛋白,Caspase-8通过诱导接近模式活化后可以作用于底物Caspase-3引起下游的级联反应引起凋亡。在正常情况下,Caspase-8存在于胞浆中,当细胞接受死亡刺激之后,Caspase-8可以与FADD结合,从而与细胞膜上的死亡受体发生间接结合,形成死亡诱导复合体,从而把死亡信号从细胞膜转化到细胞浆中去[8,9]。本研究在Beas-2B细胞中沉默和过表达WISP-3/CCN6后再接受高氧刺激24、48 h,结果发现与0 h时相比,沉默WISP-3/CCN6的肺上皮细胞中cleaved Caspase-8蛋白表达量增加,而WISP-3/CCN6过表达的肺上皮细胞中的cleaved Caspase-8蛋白表达量降低,也就是说,WISP-3/CCN6也可能影响着Caspase-8的活化。进一步研究显示,沉默WISP-3/CCN6的肺上皮细胞在高氧刺激48 h时Caspase-8的活性增强,证实WISP-5/CCN6与Caspase-8活化有关。
在高氧诱导肺上皮细胞模型当中,WISP-3/CCN6与凋亡效应蛋白Caspase-3以及其上游的凋亡启动蛋白Caspase-8和下游的凋亡效应蛋白PARP均有联系。由此推测,WISP-3/CCN6可能通过Caspase通路参与了高氧诱导的肺上皮细胞凋亡。那么WISP-3/CCN6的作用靶点在哪里?根据Caspase凋亡通路的原理,推测其作用靶点在Caspase-8或其上游。为此,本研究通过蛋白的相互作用了解WISP-3/CCN6与Caspase-8的关系。目前检测蛋白间的相互作用常用的方法是免疫共聚焦和免疫共沉淀。该研究采用的细胞仍然是Beas-2B细胞。高氧处理24 h后,经细胞打孔和免疫荧光染色,并通过共聚焦显微镜观察。结果显示,与空气环境相比,高氧刺激24 h后,WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白结合荧光信号减少。同时,我们把WISP-3/CCN6设为兴趣蛋白,用免疫共沉淀的方法把WISP-3/CCN6及其相结合的蛋白沉淀,进一步用蛋白免疫印迹法检测WISP-3/CCN6与Caspase-8的关系。结果发现,与空气环境相比,高氧刺激使WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白结合减少。这两项试验的结果表明,高氧环境中,肺上皮细胞中的WISP-3/CCN6蛋白可能通过某种机制大量丢失,其丢失导致WISP-3/CCN6与Caspase-8的蛋白结合减少,进而导致Caspase-8激活,Caspase-8的活化引起其下游的一系列凋亡因子级联激活,启动经典的Caspase凋亡途径,使肺上皮细胞大量凋亡。
综上所述,WISP-3/CCN6可能是高氧诱导肺上皮细胞凋亡的一个重要调控蛋白,也可能是防治高氧性肺损伤的一个潜在的作用靶点,值得进一步研究。然而高氧诱导肺上皮细胞凋亡的机制是异常复杂的,WISP-3/CCN6仅为其中的一个关键蛋白,是否存在其他的机制仍有待进一步研究。