材料与方法
一、材料
1.实验动物
实验选取雄性SPF级别,体质量为180 ~ 200 g的SD大鼠共18只（购于锦州医科大学动物中心）并通过动物伦理委员会批准（批号：20190816）,实验动物饲养于湿度在30% ~ 70%、温度维持在25 ℃的动物房内并采取昼夜交替光照处理。
2.主要实验药品及试剂
胆固醇（万邦实业有限公司,批号：2017 031625）,姜黄素（上海瑞永生物科技有限公司）, SREBP一抗和脂肪酸合成酶（FAS）一抗抗体（武汉Proteintech）,沉默调节蛋白6（Sirt6）一抗（武汉博士德公司）,腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）一抗（美国Cell Signaling Technology）,β-actin一抗（江苏碧云天公司） PVDF膜（Millipore公司）,SDS-PAGE凝胶（武汉博士德公司）,一抗、二抗稀释液（江苏碧云天公司）。
3.主要实验仪器
纯水仪器（湖南湘仪公司）,酶标仪（江苏碧云天公司）,组织切片机（武汉赛默飞公司）,荧光倒置显微镜（日本Olmpus公司）,凝胶电泳装置（北京六一生物科技有限公司）,显影仪（上海西唐生物科技有限公司）,脱色摇床（上海鲁硕实业有限公司）,高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。
二、方法
1.造模及分组
将18只实验大鼠随机分为3组,每组各6只,即为对照组、模型组、姜黄素组。模型组和姜黄素组予以高脂高胆固醇食物10 ml/kg灌胃,对照组给予生理盐水10 ml/kg灌胃。其中高脂高胆固醇食物的配制为60%猪油、10%胆固醇及30%玉米面加200 ml食用水,熬制成糊状,放入37℃恒温箱内,对照组给予常规饲料饲养。3个月后随机处死模型组和姜黄素组各1只大鼠,肝脏病理见肝脂肪细胞变性表明建模成功。姜黄素组给予姜黄素100 mg/kg按每日1次给药;对照组和模型组给予等量的生理盐水灌胃;持续给药4周。隔夜禁食水,次日清晨予大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,称重、解剖并左心室采血,取部分肝脏组织浸泡于4%的多聚甲醛,经脱水、石蜡包埋后行HE染色和免疫组织化学检测。
2.相关指标检测
按照试剂盒说明书进行大鼠血清中ALT、AST、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）含量测定。HE染色：4%的多聚甲醛固定大鼠肝脏组织,石蜡包埋后切片,之后行HE染色操作。免疫组织化学染色：①石蜡切片60℃下烘烤1 h;②脱蜡至水,二甲苯处理3次,每次5 min,无水乙醇处理3次,每次10 min,95%乙醇处理2次,每次10 min,dd H2O洗2次,每次5 min,0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次,每次10 min;③消除过氧化物酶体,3% H2O2溶液孵育10 min,0.01 mmol/L PBS洗3次,每次5 min;④微波抗原修复,枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）250 ml置于微波炉中450 W预热5 min,将组织放入缓冲液中,微波250 W加热10 min,冷却至室温,约耗时40 min,双蒸水洗3次,每次5 min,PBS洗3次,每次5 min;⑤封闭,利用5%的BSA封闭1 h;⑥打孔透膜,利用0.3%的Triton X-100孵育10 min;⑦一抗孵育,4℃湿盒孵育SREBP和FAS抗体过夜;⑧二抗孵育;⑨二氨基联苯胺（DAB）显色、苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明;⑩中性树胶封片和显微镜下观察结果。
蛋白免疫印迹法：①组织碾磨,将处理完成的各组大鼠肝脏组织取出,采用PBS清洗后并用手术剪刀剪取少许肝脏组织放置于组织碾磨管内,按照1∶5的比例加入组织裂解液后放置于组织碾磨仪中充分碾磨3 ~ 5 min;②离心,4℃以12 000 rpm离心15 min,取组织上清液;③蛋白质浓度测定,利用二辛可宁酸（BCA）法进行蛋白质浓度定量测定;④凝胶电泳,按照上样量为40 μg进行蛋白凝胶电泳120 min;⑤转膜,依据蛋白质marker指示进行切胶,并放置聚偏二氟乙烯（PVDF）膜进行转膜约90 min;⑥封闭,5%的脱脂牛奶封闭1 ~ 2 h;⑦孵育一抗,洗脱完成,孵育对应的一抗过夜;⑧孵育二抗,室温条件下,二抗孵育约2 h;⑨显影,将孵育完成的PVDF膜使用吐温-20的PBS洗涤2 ~ 3次,每次5 min,滴加显影液显影并拍照。
三、统计学处理
采用SPSS 18.0进行数据分析。正态分布计量资料采用$\bar{x}±s$表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
表1 各组血清生化比较（n = 6,$\bar{x}±s$） |
| 组 别 | ALT（U/L） | AST（U/L） | TG（mmol/L） | TC（mmol/L） |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 144.3±25.6 | 46.2±9.8 | 0.6±0.2 | 1.0±0.2 |
| 模型组 | 265.8±41.3a | 67.5±8.2a | 1.4±0.5a | 1.6±0.3a |
| 姜黄素组 | 152.3±18.5b | 52.5±5.0b | 0.9±0.2b | 1.2±0.3b |
| F值 | 30.75 | 11.45 | 8.91 | 7.36 |
| P值 | <0.001 | 0.001 | 0.003 | 0.005 |
注：与对照组比较,aP < 0.05;与模型组比较,bP < 0.05 |
结果
一、姜黄素对大鼠血清生化指标的影响
与对照组相比,模型组ALT、AST、TG和TC增高,差异均有统计学意义（P均< 0.05）;与模型组相比,姜黄素组ALT、AST、TG和TC均降低（P均< 0.05）。
二、HE染色观察大鼠肝脏组织形态学变化
三、免疫组织化学法检测大鼠肝脏组织中的SREBP和FAS表达
四、姜黄素对大鼠肝脏Sirt6和p-AMPK表达的影响
讨论
NAFLD是以弥漫性肝细胞脂肪病变而导致的一种病理性临床病理综合征。NAFLD是一种进展性疾病,其发病机制尚不明确。既往研究发现胰岛素抵抗、脂质代谢异常、炎性细胞因子和氧化应激所致肝细胞凋亡等因素是NAFLD发生和发展的主要原因[9]。现有研究者提出在NAFLD的“二次打击学说”中,初次主要是胰岛素抵抗所致,胰岛素抵抗主要通过促使外周脂解增加和高胰岛素血症引起肝细胞脂肪蓄积,并增加了对内、外源性损害因子敏感性。二次打击主要为反应性氧化代谢产物、脂肪细胞因子、肠应激和肠道菌群内毒素等各种损害因子诱导活动UCP-2、FAS配体等,进而使得脂肪变性的肝细胞出现炎症、坏死等一系列病理生理学改变[10,11,12]。
NAFLD是指中性脂肪在肝细胞内以脂滴或者脂质囊泡的形式在胞质中过度积累。在诸多研究中发现总胆固醇在NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎形成和发展中所起的脂毒性作用尚不完全清楚。因此,通过研究NAFLD中胆固醇合成和代谢的相关基因显得尤为重要。SREBP属于螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（bHLH-ZIP）结构家族,是一种节脂质合成的转录因子家族,是由SREBP 1a、SREBP 1c 、SREBP 2三种亚型构成[13,14]。多项研究均指出SREBPS在NAFLD的发生发展中起重要作用。近年来诸多研究也发现姜黄素可以通过降低TG、TC改善NAFLD。研究发现,姜黄素可通过下调节SREBP和FAS表达,减少脂质在肝脏内沉积,降低脂毒性对肝脏损害,进而保护肝脏细胞,使得病情得以逆转,从而治疗NAFLD[15]。对此本研究初步研究发现,相比于模型组,通过姜黄素大鼠灌胃处理的NAFLD组SREBP和FAS的表达明显下降,AST、ALT、TG和TC水平均明显降低。上述结果表明,姜黄素可能通过调节SREBP和FAS,从而降低TG、TC等合成,改善NAFLD。那么姜黄素是通过何种分子机制调控SREBP表达?
Sirt6是Sirtuins家族成员之一,具有高度保守的NAD+依赖性的去乙酰化酶,可能通过调节内皮一氧化氮合酶而发挥抗心肌肥大的作用[16]。以往研究发现,Sirt6基因缺失是导致TG累积的主要因素,与脂肪性肝脏疾病密切相关[17]。在高脂喂养的小鼠中Sirt6的表达显著降低,通过过表达Sirt6可以降低小鼠血液脂质含量,减少肝脏内脂肪的积累[18]。亦有研究证实,Sirt6可以通过增加AMP/ATP比例,活化AMPK信号通路,进而调控SREBP蛋白表达[19]。因此,在本实验研究中,我们通过蛋白免疫印迹法检测大鼠肝脏组织中Sirt6和p-AMPK蛋白表达。结果发现,相比于对照组,模型组Sirt6和p-AMPK蛋白表达均明显降低,给予姜黄素处理可以促进Sirt6和p-AMPK蛋白表达,进而改善NAFLD。综上所述,姜黄素可以减轻大鼠NALFD的脂肪沉积和肝损伤,可能与Sirt6、p-AMPK的表达上调相关。以上研究结果为姜黄素治疗NAFLD提供了新的理论依据。