肺癌是成人中最常见的呼吸系统恶性肿瘤,据WHO 2018年统计,我国肺癌新增病例数和死亡人数均居恶性肿瘤发病率和死亡原因首位[1]。非小细胞肺癌（NSCLC）与小细胞肺癌（SCLC）相比,癌细胞生长和分裂相对缓慢,肿瘤的增殖和远处转移相对较晚,但不幸的是,这些患者在得到明确诊断时,多数已经错过了最佳手术时间[2]。如果能更早地获得准确诊断,NSCLC患者将获得更全面的术后复发评估及治疗策略选择机会,使整体治疗效果或生存质量有明显的提升[3]。
循环肿瘤细胞（CTC）最早是由澳大利亚Thomas Ashwoth于1869年在一名男性转移癌患者的血液中发现[4]。CTC是从肿瘤组织中脱离出来的肿瘤细胞,通过血管内壁进入血液循环,进行远处播散和转移[5]。近年的多项研究表明,干细胞特性的CTC具有上皮-间质转化（EMT）的能力,是肝癌、乳腺癌、结直肠、肺癌等恶性肿瘤复发转移的主要始动因素,在临床分期中具有潜在应用价值,可预测多种实体瘤的预后。但由于富集技术和鉴定方法的不确定性,目前尚无用于肺癌临床的CTC检测方法[6]。因此,本研究采用纳米膜过滤富集技术,进一步用mRNA多重原位杂交法检测其类型,分析不同类型CTC与NSCLC临床病理特征相关性及其在临床应用中的价值。
对象与方法
一、研究对象
选择2016年3月至2019年10月在我院住院的121例NSCLC患者（NSCLC组）作为研究对象,患者年龄59 （31,78） 岁,其中男76例、女45例。另外选取同期在我院住院的40例非肿瘤肺部良性病变患者（良性病变组）和10名健康志愿者（健康对照组）作为对照,入选者年龄50（22,83）岁,男14例、女36例。NSCLC组纳入标准：病理诊断为NSCLC。排除标准：合并其他恶性肿瘤。良性病变组和健康对照组纳入标准：病理及临床诊断排除恶性肿瘤的肺部良性病变患者或健康人。研究方案经医院医学伦理委员会批准,入组者均已经签署知情同意书。
二、组织学评估
收集121例NSCLC术中切除标本及活组织检查（活检）标本以4%中性缓冲甲醛固定,采用石蜡包埋,3.5 μm厚切片,HE染色光镜下观察。根据“2015年WHO肺部肿瘤组织学分类标准”,由1名中级和1名副高级病理专科医师同时诊断。具体根据组织学诊断,分为肺腺癌、肺鳞癌、腺鳞癌及大细胞癌。
三、CTC检测方法
分别收集3组的外周血,采用益善公司Can PatrolTM CTC 二代技术,先使用纳米膜过滤分离CTC,再用基于分支DNA信号扩增技术进行RNA原位杂交,根据EMT标志物区分不同类型CTC。操作如下：将患者外周血5 ml移入乙二胺四乙酸二钾抗凝管,用连通器转移至红细胞裂解缓冲液处理完全混合30 min,室温下1850转/分离心5 min,然后用直径8 μm纳米膜过滤器进行分离和过滤,一般固定后,在1 ml 50%、70%、100%梯度乙醇脱水各2 min。细胞消化预处理后,使用上皮细胞黏附分子（EpCAM）、细胞角蛋白8（CK8）、CK18、CK19、波形蛋白（VIM）、TWIST转录因子1（TWIST1）和CD45基因RNA捕获探针40℃充分杂交3 h,洗涤后用支链DNA信号扩增探针40 ℃进行30 min扩增放大,使用显色缓冲液40℃温育20 min,最后DAPI染液复染全自动扫描镜检。
四、结果判定标准
根据核型特征及不同颜色荧光表达水平对细胞进行分型：镜下细胞核上有红色信号基因表达EpCAM（+）、CK8（+）、CK18（+）、CK19（+）且DAPI（+）、CD45（-）为上皮型CTC;有绿色信号基因表达VIM（+）、TWIST1（+）且DAPI（+）、CD45（-）为间质型CTC;有红色及绿色两种荧光同时表达为混合型CTC;有白色荧光信号点表达CD45（+）为非CTC;红绿白信号点均以≥7为有效表达。同一细胞仅出现上述其中一种表达,同一患者可以同时出现上述4种细胞,总的CTC数量为上皮型、间质型和混合型CTC数量之和。CTC数量≥3个/5 ml定为阳性,反之为阴性。
五、统计学处理
所有数据使用SPSS 23.0进行统计分析。计量资料因不符合正态分布,故用中位数（下四分位数,上四分位数）表示;计数资料用例（%）表示,组间比较采用$\chi$2检验或Fisher确切概率法,两两比较采用Bonferroni法;等级资料相关性应用Spearman秩相关分析。α= 0.05。
结果
一、CTC分型检测结果
二、NSCLC组、良性病变组及健康对照组各型CTC阳性率比较
NSCLC患者CTC阳性率及混合型CTC均高于良性病变组及健康对照组（P均< 0.017）,良性病变组与健康对照组3种型别CTC阳性率比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见表1。
表1 NSCLC患者与肺良性病变患者及健康人各型CTC阳性率比较[例（%）] |
| 组 别 | 例数 | CTC阳性率 | 上皮型CTC | 混合型CTC | 间质型CTC |
|---|---|---|---|---|---|
| NSCLC组 | 121 | 104（86） | 38（31） | 90（74） | 28（23） |
| 良性病变组 | 40 | 6（15） | 3（8） | 6（15） | 0（0） |
| 健康对照组 | 10 | 0（0） | 0（0） | 0（0） | 0（0） |
| 总体比较：$\chi$2值,P值 | 48.819,< 0.001 | 12.774,0.002 | 56.644,< 0.001 | 13.836,0.001 | |
| 两两比较：$\chi$2值,P值 | A vs. B | 69.923,< 0.001 | 9.051,0.003 | 44.032,< 0.001 | 11.205,< 0.001 |
| A vs. C | 36.614,< 0.001 | 3.030,0.082 | 20.432,< 0.001 | 1.727,0.189 | |
| B vs. C | -,0.327a | -,1.000a | -,0.327a | -,- |
注：A为NSCLC组,B为良性病变组,C为健康对照组;a Fisher确切概率法 |
三、不同临床病理特征NSCLC患者的CTC阳性率分布
121例NSCLC患者中,临床分期高（Ⅲ ~ Ⅳ期）者的CTC阳性率高于临床分期低（Ⅰ ~ Ⅱ期）者,有淋巴结转移（N1 ~ N3）者的CTC阳性率高于无淋巴结转移者（N0）者（P均< 0.05）。不同性别、年龄、是否吸烟、有无胸腔积液、组织分型、肿瘤大小间NSCLC患者CTC阳性率比较差异无统计学意义（P均> 0.05）,见表2。
表2 不同临床病理特征的NSCLC患者CTC阳性率分布 [例（%）] |
| 项 目 | 例数 | CTC阳性 | $\chi$2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 性别 | 0.135 | 0.714 | ||
| 男 | 76 | 66（87） | ||
| 女 | 45 | 38（84） | ||
| 年龄 | 2.957 | 0.086 | ||
| ≤60岁 | 66 | 60（91） | ||
| > 60岁 | 55 | 44（80） | ||
| 吸烟 | 1.170 | 0.280 | ||
| 是 | 30 | 24（80） | ||
| 否 | 91 | 80（88） | ||
| 胸腔积液 | 0.057 | 0.812 | ||
| 有 | 19 | 16（84） | ||
| 无 | 102 | 88（96） | ||
| 组织分型 | 0.121a | 0.728a | ||
| 腺癌 | 94 | 82（87） | ||
| 鳞癌 | 21 | 18（78） | ||
| 腺鳞癌 | 3 | 1（1/3） | ||
| 大细胞癌 | 3 | 3（3/3） | ||
| 临床分期 | 4.659b | 0.031b | ||
| Ⅰ | 23 | 18（78） | ||
| Ⅱ | 14 | 10（71） | ||
| Ⅲ | 34 | 31（91） | ||
| Ⅳ | 50 | 45（90） | ||
| 淋巴结转移 | 5.491c | 0.019c | ||
| N0 | 41 | 31（76） | ||
| N1 | 8 | 8（8/8） | ||
| N2 | 37 | 35（95） | ||
| N3 | 35 | 30（86） | ||
| 肿瘤大小 | 3.284d | 0.070d | ||
| T1 | 36 | 29（81） | ||
| T2 | 31 | 28（90） | ||
| T3 | 19 | 16（84） | ||
| T4 | 35 | 31（89） |
注：a腺癌 vs. 非腺癌;bⅠ~Ⅱ vs. Ⅲ~Ⅳ;c N0 vs. N1 ~ N3;d T1 ~ T2 vs. T3 ~ T4 |
四、临床分期、淋巴结转移与CTC数量的相关性分析
Spearman秩相关分析显示,CTC总数与临床分期呈正相关（rs = 0.254,P = 0.005）,其中上皮型CTC（rs = 0.202,P = 0.026）、混合型CTC的数量均与临床分期呈正相关（rs = 0.247,P = 0.006）,而间质型CTC与临床分期无关（P > 0.05）。CTC总数与淋巴结转移呈正相关（rs = 0.218,P = 0.016）,其中混合型CTC的数量与淋巴结转移的发生呈正相关（rs = 0.247,P = 0.006）,而上皮型CTC及间质型CTC的数量与淋巴结转移并无关（P均> 0.05）,见表3。
表3 不同类型CTC在NSCLC临床分期及淋巴结转移中的分布[中位数（下四分位数,上四分位数] 单位：个/5 ml |
| 项 目 | 例数 | 总CTC | 上皮型CTC | 混合型CTC | 间质型CTC |
|---|---|---|---|---|---|
| 临床分期 | |||||
| Ⅰ | 23 | 7（3,11） | 0（0,3） | 5（1,9） | 1（0,3） |
| Ⅱ | 14 | 10（4,12） | 1（0,2） | 7（1,13） | 1（0,3） |
| Ⅲ | 34 | 15（8,23） | 2（1,4） | 12（6,17） | 1（0,2） |
| Ⅳ | 50 | 13（6,27） | 3（1,8） | 9（3,17） | 1（0,4） |
| 淋巴结转移 | |||||
| N0 | 41 | 8（3,14） | 1（0,3） | 5（1,10） | 1（0,3） |
| N1 | 8 | 11（6,70） | 1（0,10） | 8（6,51） | 1（0,5） |
| N2 | 37 | 14（9,20） | 2（0,4） | 11（7,17） | 1（0,2） |
| N3 | 35 | 11（5,25） | 2（0,4） | 9（3,17） | 1（0,3） |
| 总计 | 121 | 11（5,20） | 1（1,3） | 8（2,14） | 0（0,2） |
讨论
近年来,为了追求精准的肿瘤治疗,对肿瘤靶向分子的精准检测提出更高的要求。NSCLC的精准治疗需要高度依赖肿瘤驱动基因的检测。然而,单纯活检并不能反映肿瘤的所有分子改变。要持续监测和了解肿瘤耐药进展中的分子变化,就不可避免地会对患者产生影响,进行复杂的有创性二次活检。目前,CTC作为液体活检三驾马车之一,为肿瘤患者实现肿瘤动态监测开辟了新的可能。由于外周血易于获得,且可以均质化的反映肿瘤细胞的全貌,对其可行性的研究也越来越多。因此,循环中的肿瘤细胞作为动态观察肿瘤预后的重要手段之一越来越受到重视[7]。
与结直肠癌、乳腺癌、肝癌等实体瘤等一样,肿瘤转移几乎成为患者死亡的直接原因。同时,CTC已被证实与多种实体瘤患者的生存期相关,有望成为独立于TNM分期的一种新的预后评估生物标记物[12]。鉴于CTC作为早期诊断和治疗指标的重要性,本研究分析了CTC与NSCLC淋巴结转移的关系,结果显示NSCLC患者的CTC阳性率与总CTC数和淋巴结转移有关。经亚组分析,上皮型和间质型CTC数与淋巴结转移无关,混合型CTC与淋巴结转移呈正相关。同时笔者还注意到,CTC阳性以混合型为主,提示CTC经历EMT的过程或疾病向严重发展[13]。这些数据有助于阐明CTC在NSCLC转移中的作用。然而,亦有研究者用同类检测方法得出不同结论,Xie等[14]的研究中仅间质型CTC与NSCLC临床病理分期呈正相关,而上皮型CTC和混合型CTC与TNM分期无关。这可能与不同实验室不同解释标准和技术方法的稳定性有关,说明该技术的稳定性还有改进空间。