近年来,由于超重和肥胖率的上升以及体育活动的减少,我国的2型糖尿病发病率迅速上升,已经成为公共卫生的主要挑战[1,2]。多项研究表明,肥胖以及2型糖尿病患者在临床及围术期中发生感染性并发症的风险更高,这可能导致脓毒症发生率增高以及ICU脓毒症相关患者的病死率增加[3,4,5]。脓毒症是宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[6]。肾脏是脓毒症发展过程中最容易受损的器官[4-5, 7]。脓毒症相关急性肾损伤（S-AKI）在ICU较为常见,同时AKI会导致脓毒症患者病死率增高。与ICU其他损伤相比,S-AKI病死率更高[8,9]。此外,有研究表明糖尿病是术后感染、S-AKI的独立危险因素[10,11]。因此,关注糖尿病患者的S-AKI成为急需解决的临床问题,然而目前研究并不多。
材料与方法
一、材料
24只6~8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠购自南京大学模式动物研究中心,体质量19 ~ 23 g,饲养于中山大学附属第三医院实验动物中心,饲养期间保持动物房室温25℃、相对湿度60%及12 h人工日光灯管照射,小鼠自由饮水和进食。普通饲料及高脂饲料分别购自中山大学实验动物中心及美国Research Diets公司,Optium Xceed 血糖仪购自美国Abbott Diabetes Care公司,4%甲醛缓冲溶液购自美国Sigma-Aldrich公司,苏木素染色液及伊红染液购自武汉塞维尔公司,蛋白酶抑制剂、乙二胺四乙酸、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自美国 Thermo Scientific 公司,PUMA及Caspase-3抗体购自英国Abcam公司,原位末端转移酶标记技术（TUNEL）试剂盒购自美国Roche公司,DAB显色剂购自丹麦DAKO公司。本动物实验经中山大学动物伦理委员会批准（批准号：IACUC-F3-161002）。
二、方法
1. 模型制备与造模
待小鼠适应环境1周后,采用随机数表法分成普食（Chow）组和高脂饮食（HFD）组,每组各12只小鼠,分别给予普通啮齿动物饲料（热量百分比为：70%碳水化合物、10%脂肪、20%蛋白质）和高脂肪饲料（热量百分比为：20%碳水化合物、60%脂肪、20%蛋白质）喂养。每2周评估体质量和每日食物摄入量,饮食干预12周后进行OGTT和胰岛素耐受性试验（IPITT）,利用GraphPad Prism 8软件计算OGTT及IPITT曲线的曲线下面积（AUC）。饮食干预结束后,分别再分为对照组（Con组）和LPS干预组（LPS组）。LPS组给予LPS 10 mg/kg腹腔注射制备小鼠S-AKI模型,Con组给予等体积磷酸盐缓冲液（PBS）腹腔注射。注射后24 h给予安乐死,通过眼球取血和收集肾组织标本进行进一步检测。
2. HE染色
取小鼠新鲜肾脏组织去除包膜,长轴方向对切。经4%多聚甲醛固定过夜,石蜡包埋切片。常规行HE染色,放大200倍,光学显微镜下观察并拍摄图像。
3. 蛋白免疫印迹法
取肾脏组织30 mg于200 μl预冷含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取40 μg样品蛋白于10%分离胶和5%浓缩胶行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜、脱脂奶粉封闭1 h,加入1∶200兔抗PUMA或者Caspase-3抗体4℃过夜孵育。次日TBS、TBST交替洗膜后加入1∶10 000 红外荧光染料标记的二抗,室温孵育1 h。TBS、TBST 交替洗膜,Odyssey双色红外激光成像系统曝光,Image-Pro Plus软件灰度分析,用目的蛋白灰度值/内参灰度值表示目的蛋白相对表达水平。
4. TUNEL检测及凋亡指数计算
取石蜡包埋的小鼠肾组织切片,根据Roche公司的TACS TdT原位细胞凋亡检测试剂盒产品说明书进行操作,检测肾脏组织凋亡细胞,DAB显色后细胞核呈棕褐色为阳性反应。每张切片随机选取20个视野（放大400倍）,于光学显微镜下观察并采集图像计数,利用Image J软件定量阳性标记的细胞;计算阳性细胞数和肾脏细胞总数,凋亡指数=阳性细胞数/肾脏细胞总数×100%。
三、统计学处理
使用SPSS 22.0分析所有数据。使用Kolmogorov- Smirnov检验数据的正态性,Levene检验用于检验方差齐性。符合正态分布的计量资料以$\bar{x}\pm s$表示,2组间比较用独立样本t检验,重复测量资料使用重复测量方差分析分析交互效应、主效应或单独效应;析因设计资料使用析因设计方差分析。α= 0.05。
结果
一、12周HFD饮食对小鼠体质量、血糖和胰岛素的影响
1. 12周HFD饮食对小鼠体质量的影响
2. 12周HFD对小鼠血糖和胰岛素的影响
OGTT与时间效应之间不存在交互作用（F = 0.803,P = 0.552）;时间主效应（F = 57.831,P < 0.001）和处理主效应（F = 28.829,P < 0.001）有统计学意义。HFD组小鼠在测试的各个时间点血糖水平均高于Chow组,同时AUC升高[（2714±378）mm2 vs.（1844±210）mm2,t = 5.319,P = 0.002）],表明HFD饮食干预后小鼠的葡萄糖耐受性变差,见图2A、B。此外,IPITT与时间之间不存在交互作用（F = 1.060,P = 0.386）;时间主效应（F = 19.690,P < 0.001）和处理主效应（F = 47.536, P < 0.001）有统计学意义; HFD组小鼠在测试的各个时间点血糖水平均高于Chow组, HFD组小鼠AUC也较Chow组增加[（1193±94）mm2 vs.（823±122）mm2,t = 6.335,P < 0.001],表明HFD饮食干预后小鼠对胰岛素治疗的反应性变差,见图2C、D。上述数据表明HFD组小鼠符合2型糖尿病的特征。
二、HFD对LPS导致AKI的影响
HE染色显示,Chow+Con组小鼠肾小球及肾小管结构正常;HFD+Con组可见肾小管区域空泡,肾小球囊腔扩大;经LPS腹腔注射的Chow+LPS组与HFD+LPS组小鼠可见肾上皮细胞变平失去正常形态,上皮细胞坏死和炎症浸润,部分肾上皮细胞核染色部分甚至完全缺失,同时肾小管腔出现中重度膨胀。其中,HFD饮食干预组小鼠肾病理损伤更为明显,见图3A。析因设计方差分析结果表明,饮食因素与LPS处理间的交互作用无统计学意义（血清肌酐F = 1.534,P = 0.244;血尿素氮F = 3.038,P = 0.112）;与各自对照组相比,LPS干预后的小鼠血清肌酐和血尿素氮均升高（LPS因素的主效应检验P均< 0.001）。HFD+LPS组血清肌酐和血尿素氮均高于Chow+LPS组（血清肌酐t = 5.430,P = 0.006;血尿素氮t = 4.881,P = 0.003）,见图3B、C。上述提示LPS对于小鼠肾组织结构及肾功能有不同程度的损伤,在HFD组损伤表现得更为明显。
三、HFD对LPS干预后肾组织PUMA蛋白水平的影响
使用蛋白免疫印迹法研究了不同组小鼠间PUMA表达水平存在差异。析因设计方差分析结果表明,饮食因素与LPS处理间的交互作用有统计学意义（F = 7.594,P = 0.025）,与对照组相比,LPS干预后的小鼠肾脏PUMA蛋白表达均升高（饮食因素固定时,LPS单独效应P < 0.001）;而与Chow+LPS组相比,HFD会明显加剧LPS导致的PUMA蛋白水平增加（LPS干预时,HFD的单独效应P < 0.001）,见图4。
四、HFD加剧LPS导致的细胞凋亡
TUNEL染色显示,Chow组小鼠肾脏组织未见细胞凋亡;而LPS处理后小鼠肾组织尤其是肾小管部分可见大量凋亡细胞。析因设计方差分析结果表明,饮食因素与LPS处理间的交互作用有统计学意义（F = 19.779,P < 0.001）并且HFD+LPS组小鼠较Chow+LPS 组凋亡细胞数量增加（HFD的单独效应P < 0.001）,见图5。
五、HFD加剧LPS导致的肾组织Caspase-3蛋白水平增加
讨论
目前肥胖与糖尿病已成为我国的重要卫生问题。一项全国调查表明,2010年中国20 ~ 59岁成年人的超重（23.0 kg/m2≤ BMI < 27.5 kg/m2）患病率高达40.7%,而2014年肥胖（BMI ≥27.5 kg/m2）患病率为12.9%[19]。另一项于2015至2017年由滕卫平教授团队进行的全国性横断面研究显示,中国成年居民的糖尿病患病率为12.8%,糖尿病前期患病率高达35.2%[1]。饮食引起的肥胖正是代谢并发症（如胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病）的主要危险因素[20]。此外,研究表明肥胖和2型糖尿病不仅会增加患者感染的风险,还是S-AKI的独立危险因素,但目前的治疗手段仍非常有限[3,4,5]。高脂喂养会导致小鼠肥胖,由于胰岛的补偿不足,进一步导致高胰岛素血症和葡萄糖稳态改变[16]。因此,该模型被认为能准确地模拟人类生理状态[21]。本研究显示,12周HFD喂养的小鼠体质量较普通饲料喂养小鼠增长更快且胰岛素耐量、葡萄糖耐量降低,表明在C57BL/6小鼠上成功构建了HFD诱导的糖尿病模型并可将其作为合适的模型进行研究。
程序性细胞死亡对于机体发育过程以及应激状态下（如DNA损伤、癌基因过表达或缺氧等）潜在异常细胞的清除至关重要[25]。肾小管损伤是LPS诱导的AKI重要特征,而肾小管上皮细胞凋亡增加是肾小管损伤的主要原因[12,13]。本研究TUNEL染色显示,经LPS干预的小鼠肾脏出现大量凋亡细胞,尤以肾小管部分为甚,而HFD+LPS组小鼠较Chow+LPS 组更为严重,提示糖尿病可能为S-AKI转归的不利因素。PUMA基因定位于 19q31 染色体,具有高度保守性;细胞应激过程中,Bcl-2家族的BH3-only蛋白PUMA被P53抑癌蛋白上调,与Bcl-2相互作用,进一步诱导细胞色素C释放,从而激活Caspase-9和Caspase-3,最终诱导细胞凋亡[15]。Wali等[26]研究显示,高血糖可通过诱导内质网应激和氧化应激导致PUMA介导的胰岛细胞凋亡;而Du等[13]发现LPS可通过上调PUMA诱导小鼠肾小管细胞凋亡。本研究中,LPS干预导致AKI的同时肾细胞凋亡数量增加,并伴随PUMA及Caspase-3蛋白表达增高,提示PUMA参与了LPS诱导的肾损伤和凋亡。此外,本研究显示HFD诱导的糖尿病小鼠在LPS干预后肾组织凋亡细胞数较普食组明显增多,PUMA蛋白及Caspase-3表达增高更为明显,提示2型糖尿病小鼠的肾脏长期处于高血糖应激状态,会加重S-AKI,该损伤加重可能与PUMA水平增高和凋亡增加有关。
综上所述,HFD喂养所致的2型糖尿病会上调肾组织PUMA蛋白的表达,进而加重LPS诱导的S-AKI以及肾脏凋亡,提示PUMA是糖尿病患者S-AKI的潜在治疗靶点。但是,本研究尚未完全阐明其具体作用机制,未来将进一步通过药物干预、细胞实验及转基因小鼠实验等探讨相关的分子机制。