材料与方法
一、材料
1. 蜕膜组织
2018年7至12月在本院计划生育门诊要求人工流产、孕6 ~ 7+6周的正常妊娠妇女（20 ~ 35岁）13例,取其人工流产术后的蜕膜组织。入组者既往月经规律,无自然流产等不良孕产史,无内科合并疾病,本次妊娠期间无阴道异常出血,B超检查提示胚胎发育正常。所有操作已通过广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会审批,入组者均已签署知情同意书。
2. 主要设备
包括低温冰箱（Baxter,美国）,恒温水浴箱（上海森信实验仪器有限公司,中国）,微量加液器（Eppendoff,德国）,生物显微镜（Olympas BX 50,日本）,台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂, 中国）,CO2细胞培养箱（Eppendorf公司,德国）, 免疫磁珠细胞分选（MACS）分离器（Mihenyi Biotec, 德国）, MACS分离柱（Miltenyi Biotec, 德国）,流式细胞仪（BD FACS Canto, 美国）,iCelligence实时细胞功能分析仪DP（ACEA, 美国）,荧光定量PCR仪Mx3000P（Agilent Stratagene, 美国）。
3. 主要材料
滋养细胞系HTR-8/SVneo由Gendie Lash 教授赠送,购于ATCC。其他材料包括胎牛血清（Gibco公司, 美国）,DMEM/F12培养基（Gibco公司, 美国）,0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Gibco公司,美国）,RPMIl640（Sigma公司,德国）,CD14一抗（Sigma公司,德国）,CY3-兔抗鼠二抗（Sigma公司, 德国）,MACS抗CDl4抗体磁珠（Miltenyi Biotec, 德国）,CD14 PerCP、HLA-DR APC、CD80 FITC、CD86 PE-Cy7、CD163 BV421、CD206 PE流式抗体（BD公司, 美国）,基质胶（Corning公司, 美国）。
二、实验方法
1. 蜕膜巨噬细胞原代培养及鉴定
收集蜕膜组织15 ~ 20 g,生理盐水充分清洗,去除残留血块。将蜕膜切成小块组织,转移至含有15 ml 消化液（含胶原酶1 g/L和DNA酶 0.04 kU/L）的50 ml离心管中。将离心管置于MACS 转子上,配平,转动30 min。取出离心管,静置2 ~ 3 min使组织沉淀。取40 μm细胞筛过滤组织上清液。重复消化2 ~ 3次。已过滤的组织上清液500×g离心5 min,弃上清。加入15 ml含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基,置于T75培养瓶中培养过夜,备用（13例组织中蜕膜细胞培养成功10例）。
次日将T75培养瓶中的贴壁细胞转移至离心管中,500×g离心5 min;用180 μl预冷的MidiMACS缓冲液重悬细胞沉淀,加入20 μl CD14磁珠,置于4℃冰箱孵育15 min。将MACS磁柱固定在分离器上,提前用1 ml MidiMACS缓冲液将柱子润湿。取800 μl预冷的MidiMACS缓冲液加入细胞中。细胞过柱,加入1 ml MidiMACS缓冲液清洗磁柱,重复3次,直至滤液澄清。收集磁柱上的细胞,500×g离心5 min,RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀,置于37℃、5%CO2的培养箱内培养。免疫荧光鉴定后将蜕膜巨噬细胞传代于6孔板中,每孔1×106个细胞,加入2 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,置于细胞培养箱内培养24 h,收集细胞上清备用。
2. 流式细胞仪检测蜕膜巨噬细胞分型次日取T75培养瓶中约1×106个贴壁细胞进行流式细胞仪检测,CD14和HLA-DR标记蜕膜巨噬细胞,CD80和CD86标记M1型蜕膜巨噬细胞,CD163和CD206标记M2型蜕膜巨噬细胞。
3. 滋养细胞系HTR-8/SVneo的表达变化检测
滋养细胞HTR-8/SVneo传代于6孔板,每孔3×106个细胞,DMEM/F12完全培养基培养。细胞贴壁后更换培养基并分组,对照组予1/2 DMEM/F12完全培养基+1/2 RPMI1640完全培养基,实验组予1/2 DMEM/F12完全培养基+1/2巨噬细胞上清。培养24 h后分别收集细胞,实时定量PCR检测AQP 1和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9表达的变化,引物序列见表1,2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。
表1 引物序列 |
| 引物 名称 | 序列 | 产物长度 |
|---|---|---|
| GAPDH | 正向TGTTCGTCATGGGTGTGAAC | 154 bp |
| 反向ATGGCATGGACTGTGGTCAT | ||
| AQP1 | 正向CTTGGACACCTCCTGGCTATT | 99 bp |
| 反向CCAGTGGTTGCTGAAGTTGT | ||
| MMP-2 | 正向TACAGGATCATTGGCTACACACC | 90 bp |
| 反向GGTCACATCGCTCCAGACT | ||
| MMP-9 | 正向CCTGGAGACCTGAGAACCAA | 105 bp |
| 反向AGATTTCGACTCTCCACGCA |
4. 滋养细胞侵袭力检测应用xCELLigence DP多功能实时无标记细胞分析（RCTA）仪,使用CIM检测板检测滋养细胞侵袭力。CIM下室铺基质胶20 μl,放入细胞培养箱4 ~ 6 h,待基质胶完全凝固后方可用于实验。根据CIM下室分组,对照组予85 μl DMEM/F12完全培养基+80μl RPMI1640完全培养基;实验组予85 μl DMEM/F12完全培养基+80 μl巨噬细胞上清液。CIM上室与下室组合,上室加入30 μl无血清DMEM/F12培养基,置于37˚C、5% CO2的培养箱平衡1 h,置于DP 系统上进行基线测量。上室加入100 μl无血清DMEM/F12 HTR-8/SVneo细胞悬液,每孔细胞数目为5×104个,均平行设置复孔。室温放置30 min后放入培养箱的仪器上,每15 min监测并记录细胞指数值（CI,CI越高代表穿过基质胶的细胞数量越多,即细胞的侵袭力越高）,连续观察48 h。
三、统计学处理
采用 SPSS 23.0对数据进行统计学处理及分析。计量资料均符合正态分布,以$\bar{x}±s$表示,组间比较采用t检验。P < 0.05 为差异有统计学意义。
结果
一、蜕膜巨噬细胞原代培养及鉴定
应用MACS分离人类早孕蜕膜巨噬细胞,可得到活性较高的巨噬细胞。应用免疫荧光方法进行巨噬细胞CD14抗体的再次鉴定,确定所分离的细胞为蜕膜巨噬细胞,见图1。
二、蜕膜巨噬细胞的M1、M2分型
应用流式细胞仪进行巨噬细胞的分型鉴定,人类早孕蜕膜巨噬细胞中以M2型为主,约占全部巨噬细胞的87%,见图2。
三、滋养细胞系HTR-8/SVneo的AQP1、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量变化
表2 滋养细胞系HTR-8/SVneo的AQP1、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量变化（$\bar{x}±s$） |
| 组 别 | n | AQP1 mRNA 相对表达量 | MMP-2 mRNA 相对表达量 | MMP-9 mRNA 相对表达量 |
|---|---|---|---|---|
| 实验组 | 10 | 1.20±0.10 | 1.04±0.09 | 1.51±0.13 |
| 对照组 | 10 | 1.00±0.04 | 1.00±0.04 | 1.00±0.04 |
| t值 | 5.937 | 1.336 | 11.983 | |
| P值 | < 0.001 | 0.198 | < 0.001 |
四、蜕膜巨噬细胞对滋养细胞系HTR-8/SVneo侵袭力的影响
讨论
滋养细胞侵袭和迁移至子宫的分子机制目前尚不清楚,但多项研究显示其侵袭过程是分子和细胞的相互作用调节,受滋养细胞本身和母胎界面微环境的精细调控。生理妊娠情况下,巨噬细胞普遍存在于母胎界面,蜕膜巨噬细胞主要参与蜕膜化的进程,促进母胎免疫耐受环境形成、协助滋养细胞侵入和螺旋动脉形成等。但蜕膜巨噬细胞和滋养细胞的生物学行为调控机制尚不清楚。本研究通过体外培养人早孕蜕膜巨噬细胞,证实早孕蜕膜组织中主要为M2 型巨噬细胞;并将蜕膜巨噬细胞在体外条件下与滋养细胞共培养,结果显示巨噬细胞可增强滋养细胞的侵袭力,而滋养细胞的AQP1及MMP-9表达升高。
巨噬细胞按照其表型和分泌的细胞因子可以分为2种极化类型,即经典活化的M1 型和选择性活化的M2型巨噬细胞[5]。母胎界面中的巨噬细胞主要为M2型,分泌高水平的抑制性细胞因子IL-10,低表达促炎性细胞因子IL-1β,因而有利于维持免疫耐受及正常妊娠状态。妊娠期疾病或者母胎界面微环境的变化可使M1型和M2型巨噬细胞发生相互转化。Li等[3]的研究显示,子痫前期孕妇蜕膜中巨噬细胞数量偏高,且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）表达过量;而GM-CSF 可诱导巨噬细胞向M1型极化[6]。因此,研究者认为M1 型巨噬细胞与子痫前期的发生密切相关。另一研究报道中,胎盘巨噬细胞CD74缺失后,活化的巨噬细胞向M1型转变,且高表达TNF-α、MCP-1等,而CD74基因敲除小鼠的子宫变小,螺旋动脉重塑受阻,并出现胚胎生长受限,研究者认为巨噬细胞向促炎方向的活化改变,干扰了滋养细胞的正常功能,导致病理妊娠[7]。
本研究通过体外培养人早孕蜕膜巨噬细胞,证实早孕蜕膜巨噬细胞中主要为M2型巨噬细胞,蜕膜巨噬细胞在体外条件下与滋养细胞共培养,结果显示巨噬细胞可增强滋养细胞的侵袭力,而滋养细胞的AQP1及MMP-9表达升高。因此,蜕膜巨噬细胞在体外培养条件下可促进滋养细胞的侵袭,这可能与调控滋养细胞AQP1的表达有关。至于是否能通过调节蜕膜巨噬细胞的活性来调节滋养细胞AQP1 的表达,进而调控滋养细胞的侵袭,预防胎盘发育异常相关疾病,还需进一步探索。