恶性肿瘤发病率逐年升高,已成为人类面临的共性问题。传统的治疗方法存在一定的局限性,近年来,新的生物技术不断被应用于临床,其中的肿瘤免疫治疗就是一种新型的抗肿瘤疗法。目前被应用于临床的肿瘤免疫治疗方法有免疫检查点治疗、细胞因子、肿瘤疫苗、过继性细胞免疫治疗（ACI）等[1]。由于ACI可以在不损害免疫系统及其功能的情况下杀死肿瘤细胞,而且能够避免肿瘤免疫逃逸,所以成为国内外研究的热点。ACI通过将体外培养、活化和基因修饰的自体或异体细胞回输至患者体内,让这类细胞在体内识别并黏附肿瘤细胞,同时诱导自体产生免疫应答进而杀伤肿瘤细胞,是一种被动免疫治疗[2]。目前,经基因修饰改造T淋巴细胞是ACI临床应用研究最深入的领域。
一、CAR-T疗法
1. 相关机制
目前,以CD19为导向的CAR-T疗法可有效治疗B淋巴细胞恶性肿瘤,通过将编码肿瘤特异性受体的转基因引入T淋巴细胞,特异性识别靶抗原从而杀伤靶细胞[5]。CAR-T疗法是基于Ig的单链可变片段（scFv）与天然完整表面抗原的结合,不依赖MHC分子识别,可避免因MHC分子表达的减少而出现的肿瘤细胞免疫逃逸。
肿瘤特异性受体中的嵌合抗原受体（CAR）含有抗原识别区、胞外铰链区、跨膜区以及细胞内的信号传递域。CAR的结构目前研发到了第4代。第1代CAR包含CD3ζ链激活的1个信号域的单链抗体抗原结合表位,CD3ζ链在T淋巴细胞活化、靶细胞裂解、IL-2分泌调节方面有重要作用,但第1代CAR在体内的增殖能力有限,容易使T淋巴细胞凋亡。第2代CAR增加了1个共刺激信号分子CD28或4-1BB（CD137）。CD28具有较强的抗肿瘤活性,而4-1BB的优点是能延长T淋巴细胞的存活时间并维持其抗肿瘤作用。第2代CAR增殖能力较第1代强,且能分泌更多细胞因子、抗凋亡蛋白[4]。第3代CAR不仅可以同时表达2个共刺激信号分子,而且能够分泌更多的IFN-γ,抗肿瘤细胞毒作用更高,但最近的研究表明,只有第2代CAR才能激活CD3ζ,并且第2代CAR比第3代具有更强的信号转导和杀瘤活性[6]。第4代CAR能够在肿瘤中分泌特定的细胞因子（如IL-12）,从而改变肿瘤微环境,并影响和激活其他免疫细胞产生免疫反应。
2. CAR-T疗法在血液肿瘤中的应用
2种抗CD19 的CAR-T——Kymriah和Yescarta被越来越多地应用于癌症治疗。CAR-T在白血病和淋巴瘤中表现出强大的抗肿瘤作用。CAR-T疗法最常作用的靶点是CD19,后续大量的研究显示治疗血液恶性肿瘤最有效的靶点包括用于血浆恶性肿瘤的CD22、CD20、ROR1、Ig的Kappa链、B细胞成熟抗原（BCMA）、CD138以及用于骨髓恶性肿瘤的CD33、 CD123和Lewis Y 抗原（LeY） 等[7]。
CD19是一种跨膜糖蛋白,表达于正常B淋巴细胞分化的各个阶段。它在多种B淋巴细胞恶性肿瘤中均有表达,包括95%以上的急性淋巴细胞白血病（ALL）、B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）[8]。CD22亦是一种特异性跨膜糖蛋白,参与B淋巴细胞的分化、存活和凋亡,亦是治疗B淋巴细胞恶性肿瘤的理想靶点,如NHL和ALL[9]。Ramos等（2017年）以CD30为靶点的CAR-T疗法效果明显。带有不同共刺激因子的以CD33为靶点的CAR-T疗法对白血病疗效显著[10]。此外,针对CD7的CAR-T疗法已被应用于临床[11]。一项研究提示,针对FLT3的CAR-T依赖于单链抗体识别CAR的结构域,也显示出良好的治疗效果,但其无法区分野生型FLT3和突变型FLT3[12]。Wang等（2018年）发现,CAR-T在体外（有或无FLT3突变）对FLT3突变白血病和急性髓细胞性白血病（AML）患者骨髓外周血单个核细胞均有特异性杀伤作用,且对FLT3内部串联重复序列（FLT3-ITD）细胞有较强的杀伤作用,因此基于FLT3配体的CAR-T疗法可能对FLT3突变AML有效。BCMA是一种维持浆细胞动态平衡的细胞表面受体,广泛表达于晚期B淋巴细胞,但在其他正常细胞上不表达[13]。Brudno等（2018年）进行的一项研究提示BCMA是CAR-T疗法治疗多发性骨髓瘤（MM）的最佳靶点。
3. CAR-T疗法在实体瘤中的应用
对实体瘤的早期临床研究显示,CAR-T抗肿瘤活性差,毒性弱。肿瘤抗原的异质性、毒性控制、浸润不足、增殖和持久性差以及复杂的肿瘤微环境（TME）是CAR-T疗法扩展到实体瘤的主要障碍。其机制可能为：①CAR-T被转移到肿瘤时虽然激发了一定程度的受体活性,但有意义的反应很少;②在TME中CAR-T缺乏实质性增殖和存活条件;③输注CAR-T后靶向抗原表达显著降低,突显了抗原丢失和抗原异质性是该疗法成功的障碍。为了避免免疫逃逸和提高安全性,肿瘤相关抗原（TAA）通常被选为CAR-T疗法的靶点,TAA在肿瘤组织中特异性高表达,但在正常组织中或多或少也会表达,这使CAR-T疗法发生非靶点交叉反应。Rosey等（2016年）的研究表明糖基化抗原可作为CAR-T疗法的理想靶点,在白血病和胰腺癌等多种癌症鼠类模型中产生强大的细胞毒性作用,由此提示糖基化抗原可能是比TAA更安全的靶点。TME中许多未知的免疫抑制机制可能与肿瘤逃避免疫监测有关,免疫检查点抑制剂可以逆转免疫抑制的TME,提高治疗效果。例如,通过干扰程序性细胞死亡蛋白-1 （PD-1）增强CAR-T的抗肿瘤疗效[14]。在肿瘤局部重复输注新鲜扩增的CAR-T可能会增强其在TME中的持久性和功能,因此,使CAR-T能够在肿瘤体内持续扩增和存活是当前探索的重点。此外,要确定CAR-T疗法是否可作为实体瘤的标准治疗方法,尚需要进行更多的临床试验。
4. CAR-T疗法的不良反应
所有CAR-T疗法均有不良反应,常见的包括细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。CRS是一种由细胞因子显著增加并伴CAR-T在体内快速激活和增殖引起的全身炎症反应,通常发生在第1次输注CAR-T后的几日内,包括发热、呼吸增快、精神异常、心律失常、皮疹和缺氧等症状[15]。2018年美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）发布了CRS和神经毒性的新定义和分级的建议,该定义和分级比较客观、便于应用[16]。已有研究报道CRS与IL-6和IFN-γ浓度升高有关,因此,细胞因子导向治疗包括IL-6受体抑制剂托西珠单抗和TNF抑制剂依那西普在CRS的治疗中起着关键作用。FDA最近批准Tocilizumab用于治疗CAR-T诱导的CRS[17]。神经毒性又称免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）,是CAR-T的另一严重不良反应,涉及脑病、寻找单词困难、闭塞和全身癫痫[16]。与CRS不同的是,神经毒性对IL-6无反应,静脉应用地塞米松和口服抗惊厥药物是可用的治疗方法。
虽然CAR-T疗法的成功为肿瘤患者带来了新希望,但仍有一些问题需要解决,例如在CAR-T疗法中出现的抗原逃逸容易导致CAR-T衰竭和疾病复发,减少甚至避免CAR-T在扩增过程中的毒性,以及因为缺乏持久性未能实现深度分子缓解等。此外,大多数实体瘤对CAR-T疗法不敏感是因为无足够的和典型的分子靶点,难以控制免疫抑制。由此可见,提升CAR-T疗法的疗效及安全性应作为研究之重。
二、TCR-T疗法
1. 相关机制
TCR-T疗法和CAR-T疗法均通过修饰患者自身的T淋巴细胞,再将它们注射回患者体内杀死肿瘤细胞,但2种疗法识别抗原的机制是完全不同的。TCR-T是由TCR α和TCR β2个结构域组成的异源二聚体蛋白,通过特异性MHC分子明确识别肿瘤细胞中蛋白的组装、修饰和加工,从而激活细胞毒作用并释放细胞因子特异性地杀伤肿瘤细胞。无论是细胞内、细胞表面还是肿瘤细胞突变后产生的新抗原,任何MHC分子提呈的抗原均能被TCR-T识别。TCR-T疗法所针对的抗原类型可分为癌-睾丸抗原、分化抗原和病毒抗原3类。TCR-T对多种肿瘤抗原有特异性,这些抗原包括CEA、HER-2、CD19、gp100、MART-1、MAGA-A3和NY-ESO-1等[18]。
2. TCR-T疗法在血液肿瘤中的应用
WT1蛋白在急性白血病（AL）和骨髓增生异常综合征（MDS）造血干细胞内过表达,但在正常组织及正常CD34+造血干细胞中表达有限[20]。Chapuis等（2013年）对11例高危AL和MDS患者实施异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后,将供者来源的CD8+ T淋巴细胞特异性靶向WT1蛋白,其中5例患者TCR-T显示出直接或间接的抗白血病活性。PRAME基因在实体瘤和ALL、AML和MDS患者体内过表达[20]。一项关于PRAME/A*02：01 TCR的早期临床试验（2017年）在德国启动,测试表达这种TCR的自体T淋巴细胞治疗高危AML、MDS和多发性骨髓瘤的疗效,目前试验仍在进行中。
3. TCR-T疗法在实体瘤中的应用
4. TCR-T疗法的不良反应
理论上,理想的肿瘤抗原应该在肿瘤细胞上表达,而不是在正常组织上表达,然而目前发现的大多数肿瘤抗原在健康组织中均有一定水平的表达,因此注入的经基因修饰改造的T淋巴细胞不仅能识别肿瘤细胞,还能识别健康组织,患者在接受TCR-T疗法治疗时会遭受靶标毒性。此外,外源性和内源性链之间存在的错配风险可能导致对自身抗原有害的识别,从而引发移植物抗宿主病。Prkhurstpa等（2011年）应用针对CEA691 699的自体TCR-T治疗转移性结直肠癌,3例患者接受TCR-T输注后发生了严重的炎症性结肠炎,说明了TCR-T疗法可引发靶标毒性。同时,正常组织表达的抗原有时会与转移的T淋巴细胞靶向的肿瘤抗原发生交叉反应,这种毒性称为脱靶毒性。Cameron等（2013年）在使用TCR-T治疗癌-睾丸抗原MAGA-A3阳性的病例时,抗MAGE-A3 TCR-T与心肌组织表达的一种不相关的Titin蛋白发生了交叉反应,引发了严重的心脏毒性,导致2例患者死亡。
TME是由多种细胞类型、细胞外基质和血管系统组成的细胞毒性致密团块,具有保护肿瘤组织和抵抗免疫细胞攻击的作用,TME减弱了TCR-T向肿瘤部位的转运能力。多项临床研究表明,只有一小部分TCR-T可以浸润到肿瘤中。此外,肿瘤的异质性导致以T淋巴细胞为基础的治疗效果有限。在经过不断尝试后,有研究数据显示抗血管生成剂可以改善输注的TCR-T的浸润效果[23]。Zhang等（2011年）的研究表明,携带IL-12的TCR-T的抗肿瘤活性显著增强,可延长带瘤动物存活时间。另一个增强抗肿瘤效应的策略是联合疗法,包括联合带有小分子抑制剂、检查点调节剂或溶瘤病毒的转基因T淋巴细胞。目前,检查点调节剂通常与T淋巴细胞联合使用以增强抗肿瘤活性。
四、结语
ACI为肿瘤患者带来了新希望,但随着研究的不断深入,作为ACI临床应用研究最深入的领域,CAR-T及TCR-T疗法仍面临着诸多问题,譬如如何克服肿瘤免疫逃逸机制,如何减低免疫激活过程中的重大毒性风险,以及如何改进制造工艺和供应链以降低成本。随着时间的推移,接触到ACI患者数量的增加使我们更迫切需要充分确定ACI毒性的驱动机制,以及评估候选产品的安全风险,制定安全的管理策略使更多患者受益。