血脂异常升高是导致心脑血管疾病发生的主要元凶。在伴有高血压、年龄超过40岁、糖尿病等危险因素存在的情况下,血脂的正常值需向下作显著的调整,以降低共患病风险而防止心脑血管疾病的发生[1]。2019年一项中国人群队列研究结果显示HDL-C < 1.3 mmol/L时缺血性和出血性脑卒中发病风险均明显增加。因此,控制血脂对健康状况的维持亚健康的预防和疾病状态的治疗具有十分重要的意义。近30年来,中国人群的血脂水平逐步升高,血脂异常患病率明显增加。据统计2012年中国成人血脂异常总体患病率高达40.4%,血清胆固醇水平的升高将导致2010至2030年我国心血管病事件约增加920万[2]。血脂异常的主要危害是增加动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）及慢性肾脏病并发动脉粥样硬化相关性心脏病的发病危险,是威胁我国人民身体健康的重要危险因素[3]。
高脂血症治疗常用他汀类药物,但其不良反应也不容忽视,比如肝损、肌溶解、血糖升高、停药后快速反弹[4]。这些不良反应阻碍了部分患者使用他汀类药物的依从性,同时也让血脂升高的亚健康人群将其拒之门外。因此,研发天然全植物成分或药食同源配方的调脂保健产品具有巨大的社会需求。本研究探讨了一种药食同源银杏红曲维生素组方（MGM）对混合型高脂血症大鼠调脂的有效性,同时在正常大、小鼠上进行急性毒性实验观察其安全性。
材料与方法
一、试剂
MGM由银杏叶提取物、红曲提取物、叶酸和维生素B6的混合物经制粒、过筛为棕红色粉末状,使用时用无菌水配置,由广州市赛普特医药科技股份有限公司提供。阳性对照品是依据南京海陵中药制药工艺技术研究有限公司申请的《预防或治疗心脑血管疾病的红曲、银杏叶组合物及其应用（专利号：CN200510041265.7）》发明专利组方而设定,以银杏叶提取物和红曲粉碎后过60目筛后按1∶1的质量比混合而成。银杏叶提取物购自浙江康恩贝制药股份有限公司;红曲提取物购自杭州双马球生物股份有限公司;叶酸、维生素B6购自江西天新药业股份有限公司。
总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、HDL-C试剂盒均购自上海科华生物工程股份有限公司;中性树胶（中国上海标本模型厂）,HE染色液（无锡市江原实业技贸总公司）。
二、仪器
BS-3000A电子分析天平（上海友声衡器有限公司）,5418台式高速离心机（德国EPPENDORF）,7020型全自动生化仪（日本株式会社日立高新技术）,JJ2000电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）,BSA224S电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。ECLIPSE Ci-S正置显微镜（尼康公司）,DHG-9145A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
三、MGM对混合型高脂血症大鼠调脂功效评价方法
健康雄性SPF级SD大鼠50只,体质量220.3 ~ 261.9 g,购自广东省医学实验动物中心。
第1次分组：大鼠检疫期结束后,按照动物体质量随机分为正常对照组10只,高脂饲料（HFC）模型组（模型组） 40只。 正常对照组给予维持饲料,模型组给予HFC,持续2周（给药前）。HFC是在维持饲料中添加20.0％蔗糖、15.0％猪油、1.2％胆固醇、0.2％胆酸钠,适量的酪蛋白、磷酸氢钙和石粉等。所有饲料均由广东省医学实验动物中心提供。
第2次分组：HFC喂养2周后,动物不禁食,使用异氟烷吸入麻醉后,眼眶静脉窦采血,3000 转/分离心10 min,分离血清,使用7020型全自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。模型组淘汰血清TC含量较低的10只动物,根据动物血清TC水平将模型组剩余动物随机分为3组。MGM的人体推荐口服剂量为0.012 g/（kg·d）,实验设约人体推荐剂量的2倍和4倍为MGM的剂量,即分别为25 mg/kg和50 mg/kg剂量的MGM组及阳性对照组（50 mg/kg）,每组10只大鼠。正常对照组大鼠按体质量灌胃给予纯净水,各给药组分别给予对应的药物溶液,每日给药1次,连续给药32 d,给药32 d后采血分离血清,测定血脂含量。
四、MGM急性毒性实验安全性评价方法
健康SPF级BALB/c小鼠,体质量19 ~ 22 g,40只;SD大鼠,体质量220.3 ~ 261.9 g,10只,雌雄各半;购自浙江维通利华实验动物技术有限公司,动物自由进食饮水。
参照《GB15193.3-2014食品安全国家标准：急性经口毒性试验》的最大耐受剂量法进行本配方的安全性评价。将40只正常的BALB/c小鼠随机分成正常组20只,MGM组20只;10只正常SD大鼠随机分成正常组4只,MGM组6只。
动物隔夜禁食后灌胃给予MGM溶液,1 d给药2次,间隔4 h,总给药剂量为23.2 g/（kg·d）是人体推荐口服剂量的1933倍。给药前后动物称重,72 h内观察记录动物死亡情况及中毒表现等;72 h时各组动物取心脏、肝脏和肾脏称量各脏器湿重,计算脏器系数 （%） = 脏器湿重/体质量×100%,然后将各脏器放入固定液中固定后进行石蜡包埋及HE染色进行各脏器组织病理学检查。
五、统计学处理
应用Graphpad Prism 7.0软件对数据进行统计和作图。正态分布定量资料用$\overline{x}±s$表示,2组间若方差齐性则采用独立样本t检验,若方差不齐则采用Welch’s校正t检验;不服从正态分布的定量资料以M（P25, P75）表示,组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。各组给药前后比较,2组数据的差值服从正态分布,采用配对t检验;不服从正态分布采用Wilcoxon符号秩和检验。α = 0.05。
结果
一、MGM对混合型高脂血症大鼠调脂功效评价
模型组大鼠喂养HFC 2周后,与正常对照组比较,血清HDL-C的含量变化不显著,表明HFC喂养对大鼠HDL-C的水平无影响;模型组大鼠血清总TC、TG和LDL-C的含量升高（P均< 0.001）,表明高脂血症大鼠模型建立成功,见表1。
表1 动物造模2周血脂含量比较[$\overline{x}±s$或M（P25,P75）] 单位：mmol/L |
| 组 别 | n | TC | TG | LDL-C | HDL-C |
|---|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 10 | 2.139±0.197 | 2.448±0.528 | 0.184±0.034 | 0.688 （0.645, 0.733） |
| HFC模型组 | 40 | 5.529±1.128 | 3.564±1.271 | 1.040±0.379 | 0.684 （0.622, 0.747） |
| t/U值 | 9.393 | 4.272 | 7.091 | 184.00 | |
| P值 | < 0.001 | 0.001 | < 0.001 | 0.706 |
正常对照组在0 d和32 d检测血清中的TC、TG和LDL-C含量未见显著变化。
25 mg/kg剂量MGM给药32 d后TC含量[（3.873 ±0.681）mmol/L]较给药前[（5.951±0.828）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg剂量MGM给药32 d后TC含量[（3.959±0.924）mmol/L]较给药前[（5.997 ±1.048）mmol/L]降低（P < 0.001）;阳性对照品给药32 d后TC含量[4.046 （3.010, 4.818）mmol/L]较给药前[6.035 （5.373, 6.775）mmol/L]降低（P = 0.004）。
25 mg/kg剂量MGM给药32 d后TG含量[（1.263 ±0.416）mmol/L]较给药前[（3.951±1.015）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg剂量MGM给药32 d后TG含量[（1.417±0.691）mmol/L]较给药前[（4.311±1.714）mmol/L]降低（P < 0.001）;阳性对照品给药32 d后TG含量[（1.427±0.400）mol/L]较给药前[（3.379±0.908）mol/L]降低（P < 0.001）。
LDL-C含量25 mg/kg剂量MGM给药32 d后LDL-C含量[（0.479±0.079）mol/L]较给药前[（1.096±0.167）mol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg剂量MGM给药32 d后LDL-C为[（0.565±0.219）mol/L]较给药前[（1.314±0.492）mol/L]降低（P < 0.001）;阳性对照品给药32 d后LDL-C含量[（0.514±0.125）mol/L]较给药前[（1.108±0.277）mol/L]降低（P < 0.001）。25 mg/kg的MGM的调脂效果与50 mg/kg剂量的阳性对照品相当,表明MGM的复方优于阳性对照品的调脂效果。
动物灌胃各试剂32 d后,正常对照组、MGM（25和50 mg/kg）组及阳性对照组大鼠血清中HDL-C的含量变化不显著,各组HDL-C含量分别为（0.534±0.081）mol/L、（0.633±0.117）mol/L、0.625（0.535,0.658） mol/L、（0.611±0.052）mol/L,说明HFC不会造成大鼠HDL-C水平的紊乱。
二、MGM急性毒性实验安全性评价
1.一般临床观察及体质量
急性毒性实验在2次灌胃后的72 h内各组均无动物死亡,大、小鼠行为活动均正常,无明显中毒反应。72 h动物解剖肉眼观察心、肝、肾等主要器官未见颜色形态异常,亦没有出血点或其他病理改变。给药前大、小鼠2组体质量比较差异无统计学意义（P > 0.05）,说明随机分组均匀。23.2 g/kg的MGM给药后,2组体质量及各脏器系数比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见表2 ~ 4。急性毒性实验结果表明MGM对大、小鼠的最大耐受量为23.2 g/（kg·d）,相当于人体推荐口服剂量的1933倍,未能测出LD50。按照急性毒性剂量分级,属无毒级。
表2 急性毒性实验给药前后大、小鼠体质量比较（$\overline{x}±s$） 单位：g |
| 组 别 | 小鼠 | 大鼠 | ||
|---|---|---|---|---|
| 给药前 | 给药后72 h | 给药前 | 给药后72 h | |
| 正常组 | 18.995±0.851 | 20.935±1.643 | 210.400±9.901 | 238.275±20.942 |
| MGM组 | 18.800±0.773 | 19.995±1.280 | 217.917±12.261 | 240.267±15.200 |
| t值 | 0.759 | 2.020 | 1.020 | 0.176 |
| P值 | 0.453 | 0.064 | 0.338 | 0.865 |
注：小鼠正常组和MGM组各20只;大鼠正常组4只,MGM组6只 |
表3 急性毒性实验大鼠各脏器系数比较[$\overline{x}±s$或M（P25,P75）] 单位：% |
| 组 别 | n | 心脏 | 肝脏 | 肾脏 |
|---|---|---|---|---|
| 正常组 | 4 | 0.363（0.338,0.390） | 3.310（3.065,3.530） | 0.808（0.772,0.870） |
| MGM组 | 6 | 0.365（0.352,0.390） | 4.057（3.430,4.593） | 0.883（0.810,0.968） |
| U值 | 11.500 | 4.000 | 4.000 | |
| P值 | > 0.999 | 0.114 | 0.100 |
表4 急性毒性实验小鼠各脏器系数比较[$\overline{x}±s$或M（P25,P75）] 单位：% |
| 组 别 | n | 心脏 | 肝脏 | 肾脏 |
|---|---|---|---|---|
| 正常组 | 20 | 0.458±0.030 | 4.058（3.680,4.418） | 1.311（1.153,1.435） |
| MGM（23.2 mg/kg）组 | 20 | 0.460±0.026 | 4.948（3.613,4.315） | 1.344（1.168,1.505） |
| t/U值 | 0.743 | 169.000 | 170.000 | |
| P值 | 0.462 | 0.410 | 0.425 |
2.组织病理学检查
2组的心脏、肝脏、肾脏等主要器官肉眼观察未见颜色形态异常,亦没有出血点或其他病理改变。HE染色结果显示与正常组比较,MGM急性给药未见小鼠和大鼠心脏、肝脏、肾脏主要脏器发生病理性损伤,各脏器结构清晰、细胞形态正常,初步数据表明MGM在高出人体推荐剂量1933倍的基础上是安全的,见图1。
讨论
高脂血症是一种慢性疾病,治疗周期长,患者需长期服药,然而长时间服用他汀类药物容易产生耐药性和不良反应。药食同源材料的复方毒性极低、适合长期服用。
红曲为传统发酵产品,红曲提取物是从红曲总体去分离得到以洛伐他汀为标准的产品,它是胆固醇合成限速酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂,其对高脂血症具有较好的预防和治疗效果,并具有抗动脉粥样斑块形成作用,红曲剂量与药效呈正相关[5]。银杏提取物中含有银杏总黄酮、银杏内酯等物质并主要以苷的形式存在。有研究发现银杏提取物能够通过调节高脂血症大鼠的多不饱和脂肪酸的分布、抑制HMG-CoA还原酶,促进粪便胆固醇的增加,进而导致胆固醇的吸收减少,以及血浆和肝胆固醇的降低,发挥调脂的作用[6]。南京海陵中药制药工艺技术研究有限公司申请的《预防或治疗心脑血管疾病的红曲、银杏叶组合物及其应用》发明专利证实红曲提取物与银杏叶提取物按1∶1配比关系配制,具有显著的协同作用。本研究所用配方是在银杏叶和红曲提取物组分的基础上进一步添加了叶酸与维生素B6,观察其与脂质代谢之间的联系。
本研究结果显示,MGM给药32 d后显著降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平,具有调脂作用,且MGM复方优于阳性对照品的调脂效果,证实MGM四组分的配方比红曲和银杏叶两组分配方具有更强的协同调脂作用。为了保证银杏叶、红曲提取物合并叶酸与维生素B6联用复方做为调脂产品的安全性,初步急性毒性实验,正常雌雄大、小鼠MGM的最大耐受剂量为23.2 g/（kg·d）,高于人体推荐剂量的1933倍,病理组织学检查MGM组动物心脏、肝脏和肾脏未见异常改变。按照急性毒性剂量分级,属无毒级,说明按推荐量食用是安全的。根据以上结果,我们可以初步判断,在人体推荐剂量范围内服用MGM是有效、安全的。