肝细胞癌（肝癌）主要由HBV感染引起,是我国第2常见的消化系统实体瘤,也是恶性肿瘤死亡的第2大原因[1]。肝癌的高病死率与其早期缺乏临床症状、在发现时大部分已处于晚期密切相关[2]。目前临床上常用的血清甲胎蛋白诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为39% ~ 64%和76% ~ 91%,其效能仍有待提高[3]。一项多中心的回顾性研究表明,Cmi（7个血清微RNA的组合）诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为70% ~ 86%和80% ~ 91%[4]。环状RNA （circRNA）与微RNA同属于非编码RNA。与微RNA相比,circRNA具有闭合环状结构,可耐受核酸外切酶,稳定性更高。有研究显示,血浆组合circRNA （circ_0000976,circ_0007750和circ_0139897）对直径≤3 cm的肝癌具有较高的诊断效能,优于血清甲胎蛋白[5]。本研究分析已发表circRNA测序结果,采用微滴数字PCR （ddPCR）检测技术,探索血浆circRNA对诊断HBV相关性肝癌的价值,现报告如下。
对象与方法
一、研究对象及资料收集
选择2019年1月至2020年12月佛山市第一人民医院收治的35例HBV相关性肝癌患者为肝癌组;同期收集30例HBV相关性肝硬化患者为肝硬化组。纳入标准：①年龄18 ~ 80岁;②有慢性乙型肝炎病史;③经肝病理活组织检查（活检）确诊为肝癌或肝硬化;④临床资料完整,在治疗前采集外周血。排除标准：外周血RNA提取总量不足。所有受试者均签署知情同意书,并经佛山市第一人民医院医学伦理委员会批准。分别记录2组患者的性别、年龄、身高和体质量,计算BMI。
二、血清甲胎蛋白检测
于患者入院后治疗前采用非抗凝干燥无菌真空管收集3~5 ml外周血,室温下以1000转/分离心5 min,取上清至EP管置-80℃保存;按照甲胎蛋白检测试剂盒（电化学发光法,罗氏公司）说明书操作要求及步骤,采用罗氏E601全自动电化学发光免疫分析仪检测血清甲胎蛋白水平。
三、血浆肝癌特异性circRNA筛选
四、血浆采集及RNA提取
于患者入院后治疗前使用经乙二胺四乙酸二钠处理的试管采集约8 ml外周血,采集后2 h内于4℃ 3000×g离心15 min获取血浆,然后立即使用miRNeasy Mini试剂盒（Qiagen）提取血浆中总RNA,操作严格按照试剂盒说明书要求进行。
五、逆转录模板DNA（cDNA）
应用逆转录试剂盒Perfect Real Time （TaKaRa）,将提取的RNA逆转录为cDNA。按照说明书配置10 μl反应体系,包括2 μl 5倍体积稀释的PrimeScript 缓冲液,0.5 μl PrimeScript 逆转录酶混合物Ⅰ,0.5 μl随机6核苷酸引物（100 μmol/L）,RNA和水配置至10 μl。反应程序：37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃保存。
六、dd PCR检测
引物序列：circ_0002867正向为5’-CCATGCCACAGTCCGCAATG-3’,反向为5’-TCCAACTGC TCCACGACACA-3’,产物长度为125 bp。ddPCR使用20 μl反应体系（2 μl cDNA,10 μl QX200 EvaGreen ddPCR Supermix,4 μmol/L上下游引物;无酶水替代cDNA设置阴性对照）在QX200 ddPCR系统上进行。向反应体系中加入70 μl微滴生成油生成微滴,吸取40 μl微滴至96孔PCR板在T100TM PCR仪器进行扩增,反应条件：95℃5 min;95℃ 30 s,64℃ 60 s,循环45次;4℃ 5 min,90℃ 5 min稳定信号;4℃保存。采用微滴分析仪和QuantaSoft软件分析检测结果。
七、统计学处理
绘图及统计分析使用SPSS 25.0和R 3.6.1。符合正态分布的计量资料采用$\bar{x}±s$表示,组间比较采用t检验;非正态分布用M（Q25,Q75）表示,组间比较采用Mann-Whitney U检验。使用logisitic回归分析（Enter法）纳入血清甲胎蛋白和血浆circ_0002867两个变量,建立回归方程,绘制受试者工作特征（ROC） 曲线分析血清甲胎蛋白和血浆circ_0002867表达水平对HBV相关性肝癌的诊断效能;采用DeLong检验分析2条ROC曲线之间的差异。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、肝硬化组与肝癌组患者的一般资料
共纳入65例患者,其中肝硬化组30例、肝癌组35例,组间年龄构成、性别构成、BMI和肝功能Child-Pugh分级比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。肝癌组血清甲胎蛋白水平高于肝硬化组（P < 0.05）,见表1。
表1 肝硬化组与肝癌组患者的一般资料比较 |
| 组 别 | 例数 | 年龄> 50岁 [例（%）] | 男性 [例（%）] | BMI （kg/m2） | Child-Pugh分级[例（%）] | 血清甲胎蛋白（μg/L） | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | B | ||||||
| 肝硬化组 | 30 | 22（73） | 21（70） | 22.37±4.63 | 17（57） | 13（43） | 16.47（4.83,117.84） |
| 肝癌组 | 35 | 20（57） | 26（74） | 23.58±4.25 | 23（66） | 12（34） | 265.44（11.30,711.66） |
| χ2/t/Z值 | 1.212 | 0.011 | 1.075 | 0.559 | -2.342 | ||
| P值 | 0.271 | 0.915 | 0.649 | 0.455 | 0.018 | ||
A：血浆circ_0002867在肝癌组和肝硬化组的表达水平;B：血浆circ_0002867与血清甲胎蛋白单独或联合诊断HBV相关性肝癌的ROC曲线 |
二、血浆肝癌特异性circRNA筛选结果
三、血浆circ_0002867、血清甲胎蛋白对HBV相关性肝癌的诊断效能
血浆circ_0002867、血清甲胎蛋白及两者联合诊断HBV相关性肝癌 [Logit（P） = -2.910+0.003×甲胎蛋白+0.095×circ_0002867]的ROC AUC分别为0.725 （95% CI 0.600 ~ 0.828）、0.670 （95% CI 0.542 ~ 0.781）、0.810 （95% CI 0.693 ~ 0.896）。血浆circ_0002867和血清甲胎蛋白两者联合诊断提高了血清甲胎蛋白单一诊断HBV相关性肝癌的效能（Z = 2.483,P = 0.013）,其他任2者比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。ROC曲线分析提示血浆circ_0002867与血清甲胎蛋白联合诊断HBV相关性肝癌的灵敏度和特异度分别为65.7%和90.0%,而血清甲胎蛋白单独诊断HBV相关性肝癌的灵敏度和特异度分别为60.0%和80.0%,联合诊断提高了诊断的灵敏度及特异度。
讨论
在中国,大多数肝癌患者都有乙型肝炎相关病史,造成炎症和肝细胞再生持续存在,炎症和肝硬化同时存在使得肝癌的早期诊断更加困难[8]。肝癌的预后与治疗时机至关重要,早期肝癌可通过手术或介入的方式取得良好的疗效,但由于肝癌早期缺乏特异的临床症状,很多患者在确诊时已处于晚期,严重影响其预后。目前血清甲胎蛋白是诊断和判断肝癌预后的重要标志物之一,但其易受炎症等指标的影响。因此,急需寻找新的生物标志物用于协助诊断肝癌。液体活检通过检测体液包括血液、尿液中的生物分子如RNA、DNA、蛋白等诊断疾病和预测患者预后,其与传统组织活检相比具有损伤小、取样方便等优势。
本研究中,我们通过分析已发表测序数据,探索血浆circRNA在HBV相关性肝癌中的诊断价值。首先,我们分别筛选肝癌组织和血浆中circRNA的差异表达谱,通过取交集的方式,寻找到肝癌特异性circRNA （circ_0002867）,2项研究中的测序结果表明circ_0002867在肝癌患者的癌组织和血浆中同时高表达。血液样本是临床中最常用的样本之一,收集和保存运输方便,重复检测可行性更强。本研究使用ddPCR检测血浆circ_0002867表达水平,ddPCR为第3代PCR技术,不需要内参基因,可实现对检测物质的绝对定量,对检测微量物质较传统的实时荧光定量PCR相比更具优势[9]。研究显示,肝癌组血浆circ_0002867表达水平高于肝硬化组,提示利用血浆circ_0002867诊断HBV相关性肝癌具有可行性。
血浆circ_0002867与血清甲胎蛋白两者联合诊断与血清甲胎蛋白单一诊断HBV相关性肝癌的ROC AUC分别为0.810和0.670。与血清甲胎蛋白相比,血浆circ_0002867与血清甲胎蛋白两者联合诊断提高了其诊断效能,尤其是提高了灵敏度和特异度。因此,两者联合可更好地诊断HBV相关性肝癌。值得注意的是,circ_0002867来源于HBV相关性肝癌的组织和血浆中circRNA差异表达谱,此研究结果是否适用于非HBV相关性肝癌,尚有待进一步研究。
综上所述,circ_0002867联合血清甲胎蛋白可提高血清甲胎蛋白的诊断效能。结合circRNA耐酶稳定和血液样本易获取的优点,血浆circ_0002867联合血清甲胎蛋白诊断HBV相关性肝癌可能具有更高的临床价值,值得进一步研究。