大肠癌是常见的消化道肿瘤之一,我国大肠癌发病率继胃癌、肺癌、食管癌之后排第4位,且呈上升趋势[1]。和其他恶性肿瘤不同的是,大肠肿瘤早期筛查、早期诊断、早期治疗能显著降低大肠癌的发病率和病死率,改善预后,有重大社会意义。目前,尚无行之有效的大肠肿瘤大规模筛查方法。DNA甲基化是大肠肿瘤发生发展过程中的一个早期事件,研究证实通过检测粪便DNA/微RNA（miRNA）基因的甲基化可早期筛查大肠肿瘤,并且多基因联合检测的筛查性能优于单基因检测。目前有较多的粪便DNA/miRNA基因甲基化标志物被研究用于大肠肿瘤筛查,其中SEPT-9和 miRNA-34b/c基因被证实具有较好的筛查性能[2,3,4,5,6]。基于此,本研究评估联合检测粪便SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化对大肠肿瘤筛查的临床性能,以期寻求更好的大肠肿瘤筛查标志物组合。
对象与方法
一、研究对象
1. 标本来源及相关临床资料
收集2017年1月至2017年7月我院术前大肠癌患者、术前大肠腺瘤患者及肠镜受检者的粪便标本及临床资料。共搜集粪便标本如下：根据纳入及排除标准,总共入组35例大肠癌 、47例大肠腺瘤、52例正常对照组。大肠癌组中,男女比例19:;16,年龄（58.72±2.34）岁;大肠腺瘤组中,男女比例25:;22,年龄（55.50±1.78）岁。按年龄、性别匹配的正常对照组中,男女比例25:;27,年龄（53.67±2.13）岁。大肠癌组、大肠腺瘤组、正常对照组的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,具有可比性。研究对象对本研究均知情同意。
2.纳入与排除标准
病例组纳入标准：①年龄≥40岁,病理组织学检查（均由一位经验丰富的胃肠道病理学专家阅片判定）确诊为结直肠腺瘤或大肠癌患者;②能收集合格粪便样本的患者。病例组排除标准：①家族性或遗传性结直肠腺瘤或肿瘤;②非原发癌灶者及不能确诊等其他情况;③合并其他系统或器官肿瘤;④同时患有炎症性肠病者;⑤术前有放射治疗或化学治疗史;⑥妊娠或有严重肝肾功能不全者;⑦肉眼见全血性大便者。正常对照组纳入标准：①年龄、性别与大肠癌组、大肠腺瘤组匹配;②肠镜检查阴性;③能收集到合格粪便样本。正常对照组排除标准：①合并其他系统或器官肿瘤;②妊娠或有严重肝肾功能不全者。
二、主要试剂
粪便DNA提取试剂盒、高分辨率熔解（HRM）分析试剂盒;亚硫酸氢盐修饰试剂盒、100%甲基化DNA标准品、0%甲基化DNA 标准品;HRM引物由上海生工公司合成。
三、实验仪器
PCR 扩增仪;LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR 仪;紫外分光光度计;-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱;电子天平;台式高速低温离心机;涡旋振荡器。
四、实验方法
使用粪便DNA提取试剂盒提取粪便DNA;对提取的DNA进行亚硫酸氢盐修饰;在Light Cycler 480 Ⅱ萤光定量 PCR仪上按设计的引物扩增目的基因CpG岛,后采用Gene Scanning分析其甲基化状态;结果判定：构建各基因甲基化标准熔解曲线,依据所检测标本熔解曲线在标准熔解曲线中的相对位置,判断其是否存在甲基化;结果由2名研究人员分别判断,如意见不同,则再次实验。基因联合检测结果判定：任一基因甲基化阳性则结果记录为阳性,两基因甲基化均阴性记录为阴性。
五、统计学处理
应用SPSS 20.0进行统计学分析。正态分布资料以$\bar{x}±s$表示,组间比较采用单因素方差分析;计数资料以例（%）表示,多组间比较采用χ2检验,两两比较采用Bonferroni法校正检验水准;组内不同检测指标比较采用配对χ2检验。α = 0.05。
结果
一、提取的粪便DNA琼脂糖凝胶电泳图
二、3组粪便SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化阳性率比较
3组的SEPT-9、miRNA-34b/c基因甲基化阳性率比较差异均有统计学意义（χ2SEPT-9 = 37.185,χ2miRNA-34b/c = 40.040,P均< 0.001）,利用Bonferroni法校正检验水准进行两两比较,大肠癌组和大肠腺瘤组的甲基化阳性率比较差异无统计学意义,两者与正常对照组比较差异均有统计学意义（P均< 0.001）。大肠癌组和大肠腺瘤组联合检测SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化阳性率均高于SEPT-9单基因检测和miRNA-34b/c单基因检测（P均< 0.05）,见表1。
表1 MS-HRM法检测粪便SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化阳性率[例（%）] |
| 组 别 | 例数 | SEPT-9 | miRNA-34b/c | 联合检测 | χ2值 | P 值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 大肠癌组 | 35 | 11（68.6）a | 25（71.4）a | 31（88.6） | χ2SEPT-9 = 5.143 χ2miRNA-34b/c = 4.167 | PSEPT-9 = 0.016 PmiRNA-34b/c = 0.031 |
| 大肠腺瘤组 | 47 | 27（57.4）a | 30（63.8）a | 36（76.6） | χ2SEPT-9 = 7.111 χ2miRNA-34b/c = 4.167 | PSEPT-9 = 0.004 P = 0.031 |
| 正常对照组 | 52 | 5（9.6） | 6（11.5） | 7（13.5） | χ2SEPT-9 = 0.500 χ2miRNA-34b/c = 0 | P = 0.500 P = 1.000 |
注：与正常对照组比较,aP < 0.05/3 |
讨论
大肠癌和其他恶性肿瘤不同之处在于大肠癌早期和晚期预后差别巨大。筛查及诊断早期大肠肿瘤,予以肠镜下切除,或者行外科手术切除,可以降低大肠癌的发病率和病死率。因此,早期筛查大肠肿瘤意义重大。
作为一种新的大肠肿瘤无创筛查标志物,DNA甲基化被部分研究证实具有良好的筛查性能,然而暂时只有个别基因甲基化检测应用于临床,仍需进一步验证其性能以及找寻更多具有良好筛查性能的基因甲基化标志物或组合。有研究证实,多基因联合检测性能优于单基因检测[7]。目前有大量DNA甲基化标志物被研究用于大肠肿瘤筛查,有较多研究报道SEPT-9和miRNA-34b/c有较好的大肠肿瘤筛查性能。甲基化敏感性HRM法检测粪便基因甲基化,已被本课题组之前的研究证实具有良好性能[5, 8-9]。 因此,在前期研究的基础上,本研究进一步探索联合检测大肠肿瘤患者粪便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化,以评价其筛查大肠肿瘤的性能。
本研究通过病例对照研究,分别检测大肠肿瘤患者及正常对照人群粪便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化情况,并将甲基化情况和研究对象的临床特征进行统计分析,发现SEPT-9和miRNA-34b/c基因在大肠癌和大肠腺瘤中有较高的甲基化率,在正常人群中甲基化率较低,与现有文献报道的甲基化率相符,进一步证实了上述2种基因甲基化检测筛查大肠肿瘤的性能。然而本研究样本量不够大,且未对不同分期、不同分化程度大肠癌进行亚组分型,或许DNA甲基化亦可作为大肠癌分期及恶性程度的辅助指标[10]。
综上所述,SEPT-9和miRNA-34b/c基因是具有较好筛查大肠肿瘤性能的标志物组合,或许将来可大规模应用于临床筛查大肠肿瘤,但仍有大量工作需要我们进一步开展,如更大样本量的研究,以及对大肠癌分亚组以研究大肠癌不同分期的甲基化情况,对甲基化与大肠肿瘤发生发展机制的进一步探索等。