材料与方法
一、材料
人胰腺癌BxPc-3细胞购自上海中科院细胞研究所;PPAR-γ激动剂罗格列酮购自美国Sigma;胰酶、高糖DMEM培养基购自美国Gibco 公司;四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒购自中国碧云天公司;鼠抗人PPAR-γ抗体及GAPDH内参购自南京凯基公司。
二、方法
1. 细胞株与培养
人胰腺癌BxPc-3细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养,细胞均呈贴壁生长。每2 ~ 3 d用0.25%胰酶消化传代1次。根据前期研究经验,将BxPc-3细胞分5组处理96 h,分别为不加药物的对照组（对照组）、加入终浓度5 μmol/L 罗格列酮组（5 μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度10 μmol/L 罗格列酮组（10 μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度20 μmol/L罗格列酮组（20 μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度40 μmol/L 罗格列酮组（40 μmol/L罗格列酮组）。
2. PPAR-γ表达水平的检测
采用蛋白免疫印迹法：收集对数生长期BxPc-3细胞,各组BxPc-3细胞加药后加入600 μl RIPA细胞裂解液,离心30 min,收集上清液即总蛋白,加2倍体积十二烷基酸钠上样缓冲液,电泳后转移至醋酸纤维膜上,脱脂奶粉封闭,加入相应一抗（PPAR-γ抗体,1∶100）,4 ℃孵育过夜,洗膜3次,加入羊抗鼠二抗（1∶10 000）,37 ℃孵育2 h, 电化学发光（ECL）法检测,感光显影。AlphaImager 2200图像系统分析灰度值,以GAPDH为内参,计算各组细胞的PPAR-γ表达水平。实验组每组设4个平行孔,实验独立重复3次,结果取平均值。
3. BxPc-3细胞增殖活性的检测
采用MTT法检测：收集对数生长期的BxPc-3细胞,各组BxPc-3细胞加药处理后加入20 μl MTT 溶液,孵育4 h,再加入150 μl二甲基亚砜（DMSO）震荡10 min,使用ELISA检测仪于490 nm 波长处测量各组吸光度值（增殖活性）。每组设4个平行孔,实验独立重复3次,结果取平均值。
三、统计学处理
使用SPSS 16.0处理数据。实验数据用 $\bar{x} \pm s$表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较行LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、不同浓度罗格列酮对BxPc-3细胞PPAR-γ表达水平的影响
5组BxPc-3细胞PPAR-γ表达水平比较差异有统计学意义（F = 40.922,P < 0.001）。5 μmol/L罗格列酮组、10 μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平与对照组比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,但20 μmol/L罗格列酮组、40 μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平升高,与对照组比较差异均有统计学意义（P均< 0.05）,且40 μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平高于5 μmol/L罗格列酮组、10 μmol/L罗格列酮组和20 μmol/L罗格列酮组（P 均< 0.05）,见图1。
二、不同浓度罗格列酮对BxPc-3细胞增殖活性的影响
MTT检测显示,5组BxPc-3细胞增殖活性比较差异有统计学意义（F = 19.966,P < 0.001）。5 μmol/L罗格列酮组、10 μmol/L罗格列酮处理后BxPc-3细胞增殖活性分别为0.60±0.07、0.57±0.06,与对照组的0.62±0.09比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）;40 μmol/L罗格列酮组细胞增殖活性为0.30±0.02,低于20 μmol/L罗格列酮组的0.45±0.03,且2组BxPc-3细胞增殖活性均低于对照组、5 μmol/L罗格列酮组和10 μmol/L罗格列酮组（P均< 0.05）,见图2。
讨论
PPAR-γ 最初发现是与胰岛素抵抗、脂肪细胞分化和器官纤维化等有关。近年研究显示其与肿瘤发生关系密切。已有报道PPAR-γ在胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、食管癌和淋巴瘤等多种恶性肿瘤中表达[7]。Tsujie等（2003年）报道PPAR-γ在包括BxPc-3细胞在内的6种胰腺癌细胞株上表达。Kristiansen等（2006年）在129例胰腺癌患者的癌组织中检测PPAR-γ,71.3%的病例中有PPAR-γ的表达,且其表达与胰腺癌的分级和分期呈正相关,推测PPAR-γ与胰腺癌有关。PPAR-γ在胰腺癌中的确切作用机制尚未阐明。Eibl等（2001年）认为,PPAR-γ可能通过诱导胰腺癌细胞凋亡,进而阻止胰腺癌细胞生长。
笔者前期研究使用罗格列酮促进BxPc-3细胞中PPAR-γ表达,结果显示罗格列酮可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞EMT及侵袭性。本实验中笔者继续将不同浓度罗格列酮作用于BxPc-3细胞,结果显示20、40 μmol/L罗格列酮可以有效促进PPAR-γ的表达,且40 μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达高于20 μmol/L罗格列酮组。MTT结果提示20 μmol/L罗格列酮组、40 μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞增殖活性明显下降,表明PPAR-γ表达可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞增殖活性。
综上所述,本研究结果初步揭示了PPAR-γ激动剂的抗胰腺癌细胞增殖特性,而探索PPAR-γ参与人胰腺癌BxPc-3细胞增殖及EMT的信号传导通路将是我们下一步的研究方向。