一、 EMT
EMT是上皮细胞向间充质细胞转化的一种进化保守生物学过程,其细胞行为改变为某些上皮特性的丧失和间充质特性的获得。EMT的发生需要大量分子因素协同作用,包括EMT诱导信号、转录因子（TF）和标志物,其表型状态是高度动态的,并依赖于细胞类型与环境,因此EMT的定义应结合细胞特性和多个分子标志物来评估,包括EMT-TF（Snail、Twist与ZeB）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）、上皮钙黏素（E-cadherin）和紧密连接蛋白-1（ZO-1）等[4]。EMT分为3型:Ⅰ型与胚胎发育和器官发育相关,Ⅱ型与炎症和纤维化相关,Ⅲ型与癌症进展相关[5]。多项研究显示,EMT参与DN的发生与发展,其中Ⅱ型EMT与DN关系密切。
二、 DN中存在EMT
刘仁海等[6]和郭红宝等[7]在高糖环境下的人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）及DN患者的肾组织中发现,E-cadherin mRNA和蛋白表达减少,Snail、Vimentin和α-SMA mRNA和蛋白表达增多,证实DN的肾脏中存在EMT过程。在高糖、AGEs等DN的关键致病因素诱导下,肾脏TEC、足细胞及内皮细胞均可发生EMT,而基础、临床实验研究均显示肾小管在DN中占更核心的地位[3]。TEC的EMT过程为:①细胞极性消失,细胞间紧密连接破坏,TEC原有表型减少,E-cadherin、ZO-1表达下调;②细胞骨架结构重组和细胞形态变化,α-SMA、Vimentin和纤维连接蛋白等间质标志物增多,成纤维细胞特异蛋白1（SP1）表达增加并与肌动蛋白、肌球蛋白相互作用,细胞突起及运动性增加;③肾小管基底膜被基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等破坏;④TEC通过受损的基底膜进入间质且侵袭力增强[8]。但有研究发现,部分在EMT过程中受损的TEC具有间质特征,并产生促纤维化因子和细胞因子,但其仍附着在基底膜上,这一现象称为“部分上皮细胞-间充质转化（PEMT）”。在PEMT过程中,TEC通过细胞周期阻滞、上皮细胞代谢改变、免疫细胞浸润、表观遗传调控以及相关信号通路参与DN的发生与发展[9]。同样,TEC的EMT过程通过不同分子机制参与DN。
三、 EMT参与DN的不同分子机制
1. DN的致病因素诱导TEC发生EMT
转化生长因子-β（TGF-β）、ROS、AGEs、炎症和表观遗传因素等是DN的致病因素,近年研究者们不断探索它们诱导TEC发生EMT的机制。
TGF-β超家族包括TGF-β家族、激活素和骨形态发生蛋白（BMP）等。TGF-β家族成员在高糖培养的TEC中增多,TGF-β1是一种成纤维细胞因子,它作为EMT最重要的调节因子,通过上调转录因子Snail并通过Smad依赖和非依赖的信号通路参与EMT[5, 12]。TGF-β1与TGF-βⅠ和Ⅱ受体结合导致Smad2/3的下游活化,其中,Smad2是TGF-β/Smad信号通路的抑制剂,上调Smad3或敲低Smad2可通过抑制核转录共抑制因子增加以Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白为主的细胞外基质（ECM）的沉积[13]。高糖也可通过TGF-β激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B （AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Notch等Smad非依赖的信号通路促进TEC发生EMT与TIF[12, 14]。此外,TGF-β超家族的另一个成员BMP-7可以抑制TGF-β1和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）诱导的EMT[12]。
在不同肾纤维化模型中,中性粒细胞浸润后巨噬细胞和淋巴细胞聚集促纤维化的细胞因子和趋化因子,刺激ECM沉积。DN患者的肾活组织检查（活检）显示炎性细胞存在于所有病理级别（Ⅰ~Ⅳ）的肾小球和间质中,且细胞黏附分子、趋化因子和促炎细胞因子的表达增加,激活了一系列信号通路参与肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化[19-20]。促炎介质NF-κB可直接与Snail、Twist等EMT-TF的位点结合,促进EMT[10]。另外,高糖与AGEs通过TNF受体相关因子3相互作用蛋白2、NF-κB和p38MAPK诱导HK-2细胞的微RNA-21（miR-21）、MMP-2及炎性细胞因子表达,如IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1,抑制抗纤维化介质RECK而促进EMT,但钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂可抑制上述过程[21]。
表观遗传学是指在不改变DNA序列的情况下,基因表达发生可遗传的变化。由DNA甲基化、组蛋白修饰或miR介导促炎和促纤维化基因表达的表观遗传调控在EMT和肾纤维化中有重要作用[9]。DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基由DNA甲基转移酶催化,通过抑制转录因子进入结合位点或促进甲基结合域蛋白的聚集,基因表达发生变化。在DN中,磷酸酶-张力同源基因（PTEN）因启动子甲基化而被抑制,从而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路使肾脏发生EMT[22]。组蛋白修饰是通过对结合DNA的组蛋白进行不同的化学修饰（包括乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化）实现对基因表达的调控,进一步通过控制转录、有丝分裂和DNA修复而参与EMT[9]。其中,乙酰化是肌成纤维细胞激活中研究最多的,组蛋白乙酰化和去乙酰化分别由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶催化。在不同的疾病模型中,抑制不同类型的组蛋白去乙酰化酶可抑制EMT和成纤维细胞的激活[14]。miR是一种小的、非编码的核苷酸,调节多种生物过程,包括EMT和癌症的侵袭性。miR-21、miR-29、miR-192和miR-200等miR通过Snail或TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和PI3K/AKT等信号通路促进或抑制DN的TEC发生EMT[12]。
上述多项研究表明,DN的致病因素相互影响地共同诱导TEC发生EMT,但EMT不是发挥单一作用导致疾病发展的,其与细胞自噬及凋亡亦有不少联系。
2. EMT与自噬的关系
自噬在降解细胞的蛋白质聚集体与受损细胞器、促进细胞存活和维持动态平衡方面起重要作用,它由UNC-51样激酶1（ULK1）、自噬相关基因13（ATG13）和分子量大小为200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白组成的ULK1复合物启动。自噬与调控蛋白Beclin-1和微管关联蛋白 1A 和 1B（MAP1LC3）表达成正比,与选择性自噬接头蛋白p62成反比。自噬主要由Beclin-1、PI3K/AKT/mTOR等信号通路控制,它们可抑制或增强EMT,而包括NF-κB、TGF-β等参与EMT的信号通路对自噬也有影响。此外,细胞骨架与线粒体之间的相互作用也是EMT和自噬的重要调节机制[10]。
2.1 自噬与EMT通过信号通路相互影响
自噬是一个复杂而动态的过程,它可促进或抑制EMT。Beclin-1为ATG6/VPS30的同源基因,它通过形成PI3K复合体来触发自噬,并直接通过上调Vimentin和Twist及降低E-cadherin的表达而加速EMT。但Beclin-1又可通过下调E盒结合锌指蛋白1、Wnt1和NF-κB抑制EMT[10]。mTOR是一种丝氨酸-苏氨酸激酶,也是TEC自噬的关键效应分子,Zhang等[23]证实了DN中上调的miR-22通过抑制靶基因PTEN,激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬而促进EMT,而mTOR受体抑制剂、自噬激活剂雷帕霉素诱导的自噬能拮抗高糖诱导的Ⅳ型胶原蛋白和α-SMA的表达。另外,沉默信息调节因子1 （SIRT1）是一种去乙酰酶,它参与细胞长寿、急性应激反应、稳态、代谢和DNA完整性的调节。在自噬过程中,MAP1LC3蛋白参与自噬体的膜形成并转化为MAP1LC3-I,这一过程依赖于SIRT1的去乙酰化,因此SIRT1是自噬正调控因子[24]。He等[24]发现通过激活SIRT1可减轻TGF-β1诱导TEC发生的EMT过程。
EMT的主要调节因子TGF-β通过刺激自噬相关基因ATG5、ATG7和Beclin-1的表达来触发自噬,而自噬通过活化环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷腺苷效应元件结合蛋白信号通路来增强TGF-β1的表达,进一步促进EMT[10]。EMT的另一个重要调节因子NF-κB,通过下调Beclin-1抑制自噬,而自噬又能通过抑制ROS/NF-κB信号通路下调MMP的表达来抑制EMT[10, 21]。Wnt蛋白家族是分泌型脂质修饰糖蛋白,高糖增加TEC的晚期氧化蛋白产物的生成,后者可通过受体CD36依赖的Wnt/β-catenin信号通路促进DN肾脏的脂毒性及EMT[25]。但自噬可通过抑制Wnt的活性并降解β-catenin靶基因Twist1而下调EMT[10]。
2.2 细胞骨架与线粒体之间的相互作用
细胞骨架由肌动蛋白丝、微管和中间丝组成,与线粒体的网络形态和各种功能相关。例如,细胞若缺失中间丝中的Vimentin,可能通过调节线粒体与微管的关联而表现出线粒体碎裂且功能紊乱。另外,EMT诱导的细胞骨架重塑会促使线粒体分裂,同时线粒体分裂为细胞EMT过程提供能量。通过激活自噬可诱导线粒体融合与网络重建,从而减少游离的线粒体及EMT发生[26]。
3. EMT与凋亡的关系
高糖使TEC产生过多ROS,当ROS水平超过抗氧化防御系统的能力时,ROS通过氧化脂类和蛋白质等细胞大分子引发连锁反应,如TEC线粒体的跨膜电位丧失、三磷酸腺苷消耗、细胞色素c释放增加、胱天蛋白酶-3（caspase-3）与caspase-9上调和凋亡相关基因Bax/Bcl-2平衡破坏,进而中断TEC活动,最终导致细胞凋亡[27]。TEC的凋亡也是在DN的环境中发生EMT及TIF的关键机制,且通过不同信号通路与EMT相互联系。Zhang等[11]在DN大鼠的TEC中发现,炎症因子CRP与其受体FCγRⅠ和FCγRⅡ增多,CRP与FCγRⅡ的结合促进了炎症微环境并诱导TEC凋亡,CRP与凋亡的TEC结合后可通过Wnt/β-catenin和ERK1/2信号通路参与TEC的EMT过程,促进DN进展。但抑制FCγRⅡ后可通过减少Wnt/β-catenin信号通路中Wnt4和磷酸化GSK-3β的表达使TEC的凋亡过程减缓[28]。另外,高糖通过ROS/MAPK/NF-κB信号通路或诱导ROS通过减弱AKT磷酸化而触发其下游蛋白GSK-3β、Bax与裂解的caspase-3的表达,导致TEC凋亡[15, 27]。ROS也能通过TGF-β1激活PI3K/AKT信号通路,加速mTOR磷酸化与EMT[16]。上述研究表明,细胞凋亡参与EMT,并共同推进DN的肾纤维化过程。然而,TEC的EMT在肾纤维化中的作用仍未有定论。
四、 EMT与肾纤维化的关系
肾纤维化的特征是ECM成分过度沉积,导致ECM与纤维化的主要细胞类型是肌成纤维细胞。而病变肾脏中来自TEC的成纤维细胞确切比例不清楚,TEC的EMT也不是肌成纤维细胞的全部来源。目前有数种方法确定肌成纤维细胞的来源,如分化标志物表达、祖细胞的标记及谱系追踪。最早,研究者们在纤维化肾脏中发现,少于15%的TEC发生了EMT过程,且TEC和胶原沉积的间质部位存在许多成纤维细胞,提示成纤维细胞可能由上皮细胞产生。谱系追踪实验进一步证明,单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠中约36%的FSP1阳性的成纤维细胞来源于TEC。然而,另一项关于肾纤维化小鼠的研究显示,50%的肌成纤维细胞来源于局部的成纤维细胞增殖,35%来源于骨髓分化,10%来源于内皮细胞向间充质细胞的转化,EMT仅占5%[5]。最近的单细胞RNA测序实验中显示,人和小鼠的肌成纤维细胞主要来源于周细胞与成纤维细胞,受损的TEC、内皮细胞和单核细胞仅有少量的ECM表达,且基因Nkd2在小鼠的肌成纤维细胞中特异性表达,成为潜在治疗肾纤维化的靶点[29]。甚至有研究者在梗阻性肾病模型中,使用Cdh16启动子的上皮示踪未发现TEC的EMT对肌纤维母细胞有影响。但是,研究者们在包括UUO、叶酸肾病和肾毒性血清性肾炎在内的肾损伤模型小鼠的TEC谱系追踪中发现,TEC发生PEMT后虽没有成为间质肌成纤维细胞,但TEC发挥旁分泌作用,促进炎症细胞与肌纤维母细胞向肾脏聚集,并激活炎症细胞分泌促纤维化的细胞因子（如TGF-β）和趋化因子,受损的TEC促进了肾脏炎症和纤维化的发生。在敲除肾小管的EMT-TF（Snail或Twist）后,以上过程被抑制,EMT减少了48.2%~64.3%,延缓肾纤维化的进程[14]。上述研究大多是使用UUO模型,因为这个模型概括了纤维化反应和肾小管损伤的各种关键特征,但研究数据存在差异,可能是因为研究条件、小鼠品系背景和基因修饰类型不同,并且EMT是一个动态的过程,检测EMT的正确时机也非常重要。
以上列举的研究主要集中在小鼠和人类肾脏活检的EMT阶段,并不能直接证明包括DN在内的肾纤维化中,TEC的EMT在人类体内真实存在,因现有技术无法在体内实时观察EMT的过程。但在体内,TEC暴露于多种诱导EMT的细胞因子与环境中,每个因子可共同参与EMT的过程,而且结合关于EMT和肌成纤维细胞活化的步骤研究,体内存在EMT的可能性不应被排除。为明确EMT是否真实存在于人类体内,关于EMT的研究需要不断的技术创新,目前的技术有单细胞实时成像、谱系追踪、基因表达分析及表观遗传修饰等。最近的活细胞成像和分析技术揭示了固有细胞表型转变的过程,由于各细胞的异质性会引起不同细胞表型转变的异质性,所以这项技术通过多路活细胞成像提取表型转变的动态信息,研究了表型转变过程是如何在多维空间沿着连续路径进行的,并得到单个细胞的全基因组表达谱成像,但在技术上,多路活细胞长时间的成像具有挑战性[30]。
五、 总结与展望
本文综述了TEC通过不同分子机制发生EMT而参与DN,阐述了TEC的EMT过程与自噬和凋亡的复杂联系,并通过EMT参与肾纤维化的实验表明EMT是肌成纤维细胞的重要来源或通过创造微环境促进纤维化,揭示了TEC的EMT过程在DN的发生与发展中具有重要作用,为治疗DN带来新角度。然而,目前无法直接证实EMT发生在人类体内中,这需要研发新的技术进行支持。若对无蛋白尿、微量及大量蛋白尿的DN患者进行单细胞测序,结合细胞分析与功能验证得到不同类别的DN患者中TEC发生EMT的异质性,有可能发现DN进展的分子变化及其应对治疗的不同反应,从而更加深入了解这些患者TEC发生EMT的不同机制,为靶向治疗和延缓肾纤维化与肾衰竭提供更多的可能性。