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文章视频简介
近年来髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）自身抗体（MOG-IgG）相关中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病成为神经免疫疾病领域关注的热点,髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体相关疾病（MOGAD）的概念被提出[1,2]。MOGAD 在儿童中的发病率高于成人,男女比例约为1:2至1:1,主要临床表现包括视神经炎、脊髓炎、脑膜炎和脑干脑炎等[3]。目前推测MOG-IgG介导的髓鞘脱失是MOGAD发生和发展的关键因素,但因缺乏患者来源的MOG单克隆抗体,MOG-IgG的致病性仍未明确。
本课题组采用基于转染细胞的亲和层析方法纯化患者来源的高特异MOG-IgG,在此基础上建立MOGAD体外脱髓鞘模型,探讨目前用于多发性硬化（MS）促髓鞘再生的临床实验药物在该模型中的髓鞘修复作用,为研究MOGAD治疗药物提供新思路。
材料与方法
一、主要实验材料
1.实验动物
出生0~2 d和7 d的SD大鼠,孕15 d的SD大鼠。实验动物均购自南方医科大学实验动物中心。
2.主要试剂及其配制
脑片培养基：50%MEM培养基、25%热灭活马血清、25%Hank’s平衡盐溶液（HBSS）、
6.5 mg/mL D-葡萄糖、1%谷氨酰胺、1%青链霉素。 神经元培养基（NBM培养基）：Neurobasal、2% B27、0.25%谷氨酰胺、0.5%青链霉素。神经元-少突胶质细胞（OL）共培养培养基（BME培养基）：BME、1% ITS、0.5%胎牛血清、4.5 mg/mL D-葡萄糖、1%谷氨酰胺、0.5%青链霉素。Control-IgG （健康人血清总IgG,10 mg/mL）,MOG-IgG（基于转染细胞的亲和层析方法获得的患者来源特异结合大鼠MOG的抗体,2.7 mg/mL）,患者血清总IgG （识别大鼠MOG的患者血清总IgG,10 mg/mL）,人源化8-18-C5单抗（100 μg/mL,该抗体的可变区序列由Markus Reindl教授馈赠）,人补体。MBP抗体（Proteintech）,β-actin抗体（Boster）,NF抗体
（Aves Lab）,山羊抗兔HRP二抗、山羊抗鼠HRP二抗（Proteintech）,山羊抗兔-488荧光二抗、山羊抗鸡-546荧光二抗（Invitrogen）。喹硫平、奥利索西、氯马斯汀、多潘立酮均购自MCE公司。
6.5 mg/mL D-葡萄糖、1%谷氨酰胺、1%青链霉素。 神经元培养基（NBM培养基）：Neurobasal、2% B27、0.25%谷氨酰胺、0.5%青链霉素。神经元-少突胶质细胞（OL）共培养培养基（BME培养基）：BME、1% ITS、0.5%胎牛血清、4.5 mg/mL D-葡萄糖、1%谷氨酰胺、0.5%青链霉素。Control-IgG （健康人血清总IgG,10 mg/mL）,MOG-IgG（基于转染细胞的亲和层析方法获得的患者来源特异结合大鼠MOG的抗体,2.7 mg/mL）,患者血清总IgG （识别大鼠MOG的患者血清总IgG,10 mg/mL）,人源化8-18-C5单抗（100 μg/mL,该抗体的可变区序列由Markus Reindl教授馈赠）,人补体。MBP抗体（Proteintech）,β-actin抗体（Boster）,NF抗体
（Aves Lab）,山羊抗兔HRP二抗、山羊抗鼠HRP二抗（Proteintech）,山羊抗兔-488荧光二抗、山羊抗鸡-546荧光二抗（Invitrogen）。喹硫平、奥利索西、氯马斯汀、多潘立酮均购自MCE公司。
二、实验方法
纯化患者来源的MOG-IgG,通过MOG-IgG和补体共同作用建立MOGAD体外脱髓鞘模型,应用该模型进行MOGAD促髓鞘再生药物研究。本研究已获中山大学动物伦理委员会审批（批件号：SYSU-IACUC-F3-21-0301）。
1.患者来源特异性结合大鼠MOG抗原的抗体制备
从MOG-IgG阳性患者血清中筛选出识别大鼠MOG的血清,经20 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）稀释后与转染并表达大鼠MOG的细胞于培养皿孵育1 h,后加入0.1 mol/L Glycine-HCl洗脱液（pH 2.7）洗脱下结合的抗体,再用1 mol/L Tris-HCl中和液（pH 9.0）中和。进一步采用Protein A亲和层析方法分离纯化抗体,脱盐,浓缩。
2.大鼠小脑切片髓鞘模型的建立
参考文献[4]的方法,选用出生7 d的SD大鼠,于无菌环境下剥离出小脑并撕去脑膜,使用振动切片机沿矢状面切割小脑,将小脑切片种到Transwell小室中,记为第0日。
3.大鼠皮层神经元-OL共培养的细胞髓鞘模型的建立
参考文献[5]的方法,取孕15 d的SD大鼠用于神经元培养,于无菌环境下剥离并消化胚胎大脑皮层,将细胞接种至24孔板（8×104个细胞/孔）,记为第0日。取出生0~2 d SD大鼠用于培养少突胶质前体细胞（OPC）。神经元培养至第21日时,将OPC添加至24孔板里（6×104个细胞/孔）,记为共培养的第0日。
4.脱髓鞘模型的建立及药物筛选
神经元-OL共培养的第14日更换损伤培养基（健康对照组、MOG-IgG组：10%相应抗体+10%补体+ 80% BME培养基）作用24 h,共培养第15日固定细胞爬片。为检测经小脑切片模型验证有效的髓鞘再生药物对神经元-OL共培养的脱髓鞘模型的髓鞘修复作用,Control-IgG或MOG-IgG与补体损伤作用24 h后更换修复培养基[健康组：BME培养基;对照组：BME培养基（损伤后不给药）;实验组：含不同浓度药物的BME培养基],共培养第30日固定细胞爬片。
5.蛋白免疫印迹法
小脑切片组织裂解后,行SDS-PAGE凝胶电泳、半干法转膜,用3%脱脂牛奶封闭,分别作用于相应的一抗（MBP：1:1000;β-actin：1:2000）和二抗（1:2000）。用化学发光成像仪成像。用ImageJ软件分析条带的灰度值,以β-actin为内参,对MBP的相对表达量进行统计分析。
6.免疫荧光法
小脑切片经4%多聚甲醛固定1 h,1% TritonX-100通透20 min,10%山羊血清+0.25% TritionX-100封闭1 h,分别作用于相应的一抗（MBP抗体：1:400;NF抗体：1:800）和荧光二抗（1:500）。细胞经3%多聚甲醛固定20 min,0.3% TritonX-100通透20 min,10%山羊血清+ 0.1% TritionX-100封闭1 h,分别作用于相应的一抗（MBP抗体：1:400;NF抗体：1:800）和荧光二抗（1:500）。用共聚焦显微镜拍照。用ImageJ软件进行共定位分析。
三、统计学处理
用GraphPad Prism 9.0软件分析数据并绘图,数据以 $\bar{x}±s$ 表示。2组间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析,事后多重比较用Dunnett法。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、患者来源特异性结合大鼠MOG的抗体制备结果
本研究基于大鼠小脑切片和神经元-OL共培养的髓鞘模型,为避免抗体识别抗原可能的种属特异性,将人和大鼠MOG进行氨基酸序列比对,结果显示,人和大鼠MOG同源性为88.99%。进一步分析110例MOG-IgG阳性患者血清,其中仅20例可识别大鼠MOG。为精确反应MOG-IgG的致病性,建立基于转染细胞的亲和层析方法纯化抗体（图1A）,构建绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒和大鼠MOG表达质粒,将识别大鼠MOG的血清（10 mL,25 mg/mL,滴度1:100）与共转染上述2种质粒的细胞孵育结合并洗脱得到识别大鼠MOG的IgG（rMOG-IgG）,再用Protein A亲和层析方法进一步纯化,进而浓缩得到高特异识别大鼠MOG的IgG （1 mL,2.7 mg/mL,滴度1:320）,经本方法纯化后的MOG-IgG相对滴度提高约30倍（图1B）。
二、MOG-IgG在补体参与下直接介导髓鞘损伤
采用小脑切片髓鞘模型研究MOG-IgG的致病性,小脑切片各组MBP表达水平差异有统计学意义（F = 27.600,P < 0.001）,与健康对照组相比,患者总IgG组、MOG-IgG组、8-18-C5组MBP表达水平均降低（P = 0.009,P < 0.001,P < 0.001）,提示患者总IgG、MOG-IgG和人源化8-18-C5单抗在补体协同作用下均可造成髓鞘损伤（图2A~C）。小脑切片免疫荧光结果显示,与健康对照组相比,MOG-IgG组MBP-NF共定位区域减少（t = 9.496,P < 0.001）（图2E、F）,表明MOG-IgG在补体参与下直接介导髓鞘损伤。进一步应用神经元-OL共培养的细胞髓鞘模型验证该结果,与健康对照组相比,MOG-IgG组MBP-NF共定位区域减少（t = 12.090,P < 0.001）（图2D、G、H）。上述结果均表明MOG-IgG在补体参与下直接介导髓鞘损伤。
三、氯马斯汀和多潘立酮在MOGAD体外脱髓鞘模型中显著促进髓鞘再生
小脑切片损伤后给药,与对照组相比,氯马斯汀和多潘立酮组中MBP表达水平升高（图3A）。经不同浓度氯马斯汀、多潘立酮作用,小脑切片各组MBP表达水平差异有统计学意义（F = 9.009,P = 0.002;F = 8.675,P = 0.001）。与对照组相比,100 nmol/L氯马斯汀组MBP表达水平升高（P = 0.030）,500 nmol/L、1 μmol/L氯马斯汀组差异无统计学意义（P = 0.212,P = 0.697）（图3B）;100 nmol/L多潘立酮组MBP表达水平升高（P = 0.001）,20 nmol/L、500 nmol/L、2.5 μmol/L多潘立酮组比较差异无统计学意义（P值分别为0.574、0.230、0.997）（图3C）。上述结果表明,100 nmol/L氯马斯汀和100 nmol/L多潘立酮在小脑切片MOGAD体外脱髓鞘模型中促进髓鞘再生,故后续实验均选用100 nmol/L作为氯马斯汀和多潘立酮的给药浓度。
小脑切片脱髓鞘模型、神经元-OL共培养脱髓鞘模型给药后的免疫荧光结果显示,各组髓鞘形成指数差异有统计学意义（F = 24.320,P < 0.001;F = 23.73,P < 0.001）,与对照组相比,分别给予100 nmol/L氯马斯汀和100 nmol/L多潘立酮后,MBP-NF共定位区域均增多（P均< 0.001）（图4）。上述结果均表明,在MOGAD体外脱髓鞘模型中,100 nmol/L氯马斯汀、100 nmol/L多潘立酮均促进髓鞘再生。
讨论
人MOG特异表达于中枢神经系统OL胞膜上,参与髓鞘黏附、细胞表面的相互作用。MOG-IgG只结合定位在细胞膜上具有天然构象的MOG抗原,具有不同表位和高度的免疫原性,是中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病中重要的自身免疫抗体和细胞免疫反应的靶点[8,9]。2011年Mader等[10]报道MOG-IgG阳性患者的IgG在体外过表达MOG的HEK293细胞中产生补体依赖的细胞毒。2017年Peschl等[11]证实MOG-IgG阳性患者的IgG在体外培养的小脑切片中产生补体依赖的细胞毒并导致髓鞘损伤。这些研究多采用患者来源的总IgG,MOG-IgG仅是其中的一部分,且患者来源的总IgG可能还伴有其他自身免疫抗体,因此获得高特异的MOG-IgG对研究其致病性至关重要。
MOGAD是近年来提出的一种免疫介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,已受到广泛关注,建立MOGAD体外脱髓鞘模型对研究该疾病发病机制具有重要意义。髓鞘再生一直是神经系统疾病研究的热点和难点,髓鞘再生受阻主要原因是脱髓鞘区域的OPC不能分化为成熟的OL[12,13]。因此,越来越多的研究者致力于寻找能够促进OPC分化与髓鞘再生的小分子化合物,或者是能够干预上述过程的信号通路[14,15]。Mei等[14]发现氯马斯汀显著促进OPC分化和髓鞘形成,也有临床研究表明氯马斯汀可改善由MS引起的慢性脱髓鞘症状,提示该药物在脱髓鞘疾病中有广阔的应用前景[16]。多潘立酮是D2/D3多巴胺受体拮抗剂,可促进催乳素的分泌,催乳素在髓鞘修复过程中发挥重要作用,因此多潘立酮被认为是髓鞘再生治疗的潜在药物[17]。
本研究采用基于转染细胞的亲和层析方法,纯化患者来源高特异的MOG-IgG,并证实MOG-IgG在补体协同参与下直接介导髓鞘损伤,由此建立MOGAD体外脱髓鞘模型,发现氯马斯汀和多潘立酮在该模型中显著促进髓鞘再生。然而本研究也有一定局限性,缺少动物体内实验,MOG-IgG结合补体介导脱髓鞘损伤作用机制、氯马斯汀和多潘立酮促进MOGAD体外脱髓鞘模型髓鞘再生的具体机制尚需进一步深入研究。