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AMI后心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤可诱导更多的氧自由基产生, 最终导致心肌细胞凋亡, 甚至死亡。因此, 抑制氧化应激和细胞凋亡将有助于MI/R损伤的治疗。目前尚无有效的药物或操作方法治疗MI/R。Wang（2015年）等认为, 小分子肽Elabela及其配体APJ信号通路与心血管病理生理密切相关, 其主要在心脏血管的内皮细胞中表达。Elabela对心脏胚胎发生至关重要。Chng（2013年）、Pauli（2014年）, Peverelli（2014年）等相继发现, 缺乏Elabela的鱼类会出现严重的心脏发育不良, 甚至缺如。同时他们也发现, Elabela可以通过引导血管细胞迁移到中线, 改变细胞内钙稳态, 以及激活磷酸化Smad3等途径来促进血管生成[1]。Elabela/APJ还可引起冠状动脉扩张, 增强心肌收缩力, 改善左心室肥厚和心肌间质纤维化以及抗高血压作用[2⇓⇓⇓-6]。但是, 到目前为止, Elabela对MI/R的影响尚不清楚。人类中枢神经系统通过从迷走神经末端释放乙酰胆碱并激活炎症细胞中的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）来阻断促炎分子的产生[7]。Pavlov 等（2003年）认为α7nAChR是一种配体门控离子通道, 其主要作用是转运神经系统中的乙酰胆碱。当其与乙酰胆碱结合时, α7nAChR的抗炎信号传导至细胞质, 激活Janus激酶2 /信号转导子和转录激活子3（JAK2/STAT3）信号通路, 启动抗炎转录。因此, 迷走神经可能通过乙酰胆碱/α7nAChR抑制炎症、细胞凋亡、氧化应激和促进血管生成来治疗心血管疾病。在本研究中, 笔者评估了Elabela对H9C2细胞凋亡和氧化应激的影响及其潜在的机制, 现报道如下。
对象与方法
一、研究对象
笔者连续招募了北京佑安医院26例ST段抬高型心肌梗死患者（STEMI组）和同期的26名健康受试者作为对照（对照组）。所有心肌梗死患者均为首次发生心肌梗死, 并在症状出现后12 h内住院治疗。STEMI在入院时诊断需符合以下标准, 包括临床症状、典型心电图表现、心肌肌钙蛋白-Ⅰ（cTnⅠ）和CK-MB含量增加以及冠状动脉造影的结果。对照组则定义为冠状动脉无明显有意义的狭窄（狭窄< 50%）。排除标准：年龄< 18岁或 > 80岁、心肌病、感染性疾病、活动性炎症疾病、血液系统疾病、肿瘤晚期、严重肝肾功能不全且拒绝进入研究者。笔者通过电子医嘱系统获得受试者的人口统计学信息。所有受试者在入院后24 h内采集静脉血以检测血浆Elabela水平。使用Elabela（人）试剂盒（美国半岛实验室, 货号：S-1508）对Elabela的血浆浓度进行定量检测, 操作按试剂盒说明进行。本研究获取了首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会的批准（LL-2021-004-Y）, 所有受试者均签署了书面知情同意书。
二、主要试剂和抗体
DMEM/F12培养基（DMEM, 产品编号sh30023.01b）和胎牛血清（产品编号sv30087.03）购自美国Hyclone公司, 过氧化氢（H2O2, 产品编号RJ0523）购自德国Bioruler, 乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所, 细胞计数试剂-8（CCK-8试剂盒, 产品编号C0038）、荧光探针二氢乙锭（DHE）均购自Beyotime公司（中国江苏）, Bcl-2、Bax、GAPDH抗体均购自ProteinTech公司（美国芝加哥）, α7nAChR抗体购自英国剑桥Abcam公司, p-JAK2、t-JAK2、p-STAT3、t-STAT3抗体购自Cell Signaling Technology公司（美国马萨诸塞州）, 凋亡检测试剂盒购自Becton, Dickinson and Company（美国纽约BD公司）, ELA-32（人, 是Elabela经剪切后的一个成熟肽, 含32个氨基酸）（产品编号6291/100U）、Quantinova Rev转录试剂盒（产品编号205411）、Quantinova SYBR PCR试剂盒（产品编号208054）和RNeasy迷你试剂盒（产品编号74104）购自德国Qiagen公司。
三、细胞培养和处理
大鼠心肌细胞H9C2（大鼠胚胎心脏克隆细胞系, 产品编号：JNO-19363-1）购自中国广州吉妮欧生物科技有限公司。细胞培养基由10%（V/V）胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素和DMEM组成。细胞在培养皿中培养, 然后接种在6孔板中, 用ELA-32和（或）α-银环蛇毒素（α-BTX, Sigma）预处理30 min （H2O2 + ELA-32组和H2O2 + ELA-32 + α-BTX组）。向细胞培养基中添加H2O2（最终浓度为400 μmol/L）2 h（H2O2组）, 收集H9C2或上清液进行后续分析。
四、细胞活力测定
H9C2（6×104个细胞/mL）在对数期时接种在96孔板上, 根据试剂盒的说明, 使用CCK-8分析方法评估H9C2的细胞活力。
五、LDH、SOD和MDA试验
使用LDH检测试剂盒检测细胞上清液中的LDH浓度。使用SOD、MDA试剂盒检测培养基中SOD、MDA的活性。
六、细胞凋亡检测
使用Annexin V异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）试剂盒在BD流式细胞仪上检测细胞凋亡水平, 使用FlowJo VX软件对细胞凋亡率进行量化。
七、DHE染色
使用组织活性氧（ROS）检测试剂盒（DHE）处理细胞后在荧光显微镜下直接观察, 利用ImageJ软件量化细胞内ROS的水平。
八、蛋白免疫印迹法
蛋白经提取、变性、电泳、电转后, 将Bax、Bcl-2、α7nAChR、p-JAK2、t-JAK2、p-STAT3、t-STAT3和内参GAPDH的抗体（稀释比例为1∶1000）培养过夜, 清洗后再将抗兔二抗添加到膜上, 然后用Licor系统扫描。根据蛋白免疫印迹条带的光密度测定蛋白表达。
九、实时荧光定量（RT）-qPCR
通过RNeasy试剂盒从H9C2细胞中提取总RNA, 通过转录试剂盒从RNA中反转录产生cDNA。用SYBRTM Green PCR混合物（Thermo Fisher Scientific, Inc.）在ABI 7500热循环上运行RT-qPCR-ΔΔCt法用于量化最终结果。本研究中使用的引物为：Elabela正向5′-GCGAGTCTCTCTCTCT-TTTATCAGG-3′和反向5′-ATCTCCGGCGAAAGAGA-GTTG-3′, GAPDH正向5′-TGATTCTACCCACGGCA-AGTT-3′和反向5′-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3′。
十、统计学处理
采用SPSS22.0软件进行统计分析。计数资料以百分率（%）表示, 比较采用χ2检验。计量资料以 表示, 比较采用t检验, 多组间比较用单因素方差（One-way ANOVA）分析, 组间两两比较用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。柱状图应用GraphPad Prism 8.0软件进行绘图。
结果
一、STEMI受试者血浆中的Elabela水平增加
表1 对照组和STEMI组基线资料比较 |
| 变 量 | 对照组（26例） | STEMI组（26例） | t / χ2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 男性/例（%） | 11（42） | 15（58） | 1.231 | 0.267 |
| 年龄 /岁 | 61.30±11.36 | 62.00±11.46 | 0.219 | 0.828 |
| 高血压/例（%） | 12（46） | 17（65） | 1.949 | 0.163 |
| 糖尿病/例（%） | 9（35） | 7（27） | 0.361 | 0.548 |
| 脑梗死/例（%） | 2（8） | 4（15） | 0.165 | 0.668 |
| 慢性肾脏病/例（%） | 0 | 0 | - | - |
| 外周血管疾病/例（%） | 0 | 0 | - | - |
| 吸烟史/例（%） | 9（35） | 14（54） | 1.949 | 0.163 |
| BMI/（kg/m2） | 26.10±2.87 | 25.60±1.91 | 0.742 | 0.461 |
| 高脂血症/例（%） | 5（19） | 6（23） | 0.115 | 0.734 |
| 收缩压/mmHg | 130.30±19.45 | 136.50±25.39 | 0.891 | 0.377 |
| 舒张压/mmHg | 70.90±8.73 | 72.90±9.27 | 1.876 | 0.067 |
| 总胆固醇/（mmol/L） | 4.42±1.11 | 4.75±1.15 | 1.004 | 0.321 |
| HDL-C/（mmol/L） | 1.07±0.30 | 0.94±0.19 | 1.707 | 0.094 |
| LDL-C/（mmol/L） | 2.57±0.99 | 2.90±0.83 | 1.283 | 0.206 |
| 甘油三酯/（mmol/L） | 1.50±0.73 | 1.97±1.00 | 1.869 | 0.068 |
| 尿素氮/（mmol/L） | 5.65±2.15 | 5.27±1.26 | 0.773 | 0.443 |
| eGFR/[mL/（min·1.73m2）] | 63.80±21.06 | 65.56±14.27 | 0.336 | 0.738 |
| GHbA1c/% | 6.25±1.06 | 6.28±1.09 | 0.108 | 0.914 |
| cTnⅠ/（ng/mL） | 1.62±0.04 | 122.00±18.67 | 4.177 | <0.001 |
| BNP/（pg/mL） | 135.00±13.67 | 550.00±21.34 | 4.531 | <0.001 |
| Elabela/（ng/mL） | 71.89±8.90 | 92.04±23.14 | 4.141 | <0.001 |
注：eGFR为估算肾小球滤过率;BNP为B型脑钠肽; 1 mmHg = 0.133 kPa。 |
二、H2O2处理后Elabela表达增加
用RT-qPCR评估H2O2处理后Elabela的表达, 结果表明经H2O2处理上调了Elabela表达水平（2-ΔΔCt：1.007 vs. 5.640, t = 40.883, P < 0.001）。
三、ELA-32预处理增强H9C2细胞活力
与对照组相比, 使用200 nmol/L和500 nmol/L ELA-32预处理增加了H9C2细胞活力, 2组比较差异有统计学意义（F = 21.029, P < 0.001）, 而在200 nmol/L和500 nmol/L组间细胞活力比较差异无统计学意义（F = 21.029, P = 0.570）（图1）。因此, 后续实验决定使用200 nmol/L ELA-32进行30 min的预处理。
四、ELA-32预处理保护H9C2细胞免受H2O2诱导的细胞损伤
LDH的释放水平反映了细胞损伤的程度。H2O2可以明显增加H9C2细胞的LDH释放水平[（38.6±1.14）U/L vs. （83.6±5.22）U/L, P组间<0.001], 而ELA-32预处理可以逆转这种有害作用[（83.6±5.22）U/L vs.（62.2±12.39）U/L, P组间 = 0.001, F = 41.688, P < 0.001, n = 5]。
五、ELA-32预处理减少H2O2诱导的氧化应激损伤
与对照组相比, H2O2组ROS阳性细胞数量明显增加（F = 800.457, P < 0.001）, 但在ELA-32处理后ROS阳性细胞数则减少（F = 800.457, P <0.001） （图2A、B）。此外, 经H2O2处理H9C2细胞后, SOD水平降低（F = 10.929, P < 0.001）, MDA水平升高（F = 7.089, P = 0.001）, 而ELA-32的预处理逆转了这种有害效应, 差异均有统计学意义（SOD、MDA分别为P = 0.001、P = 0.045） （图2C、D）。这些结果均表明, ELA-32可能抑制H2O2诱导的ROS生成, 减少H9C2细胞损伤。
六、ELA-32减少H2O2诱导的H9C2细胞凋亡
七、ELA-32对α7nAChR/JAK2/STAT3通路的影响
为探索ELA-32是如何保护H9C2细胞的, 研究对H9C2细胞中α7nAChR、p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3的水平进行定量研究。结果发现, 与对照组相比, 在H2O2处理后的α7nAChR、 p-JAK2和p-STAT3的蛋白质水平表达降低, 而ELA-32预处理组的α7nAChR、p-JAK2、p-STAT3表达水平升高, 差异均有统计学意义（图4A~D, P均<0.05）, 表明ELA-32可以影响α7nAChR/JAK2/STAT3信号通路中关键蛋白质的表达。
八、ELA-32通过α7nAChR介导的JAK2/STAT3途径抑制H2O2诱导的H9C2细胞损伤
图5 Elabela通过α7nAChR/JAK2/STAT3信号通路发挥心肌保护的作用注：A、C为α-BTX逆转Elabela的抗凋亡作用, 与对照组比较, *P < 0.001, 与H2O2组比较, #P < 0.001, 与ELA-32组比较, &P < 0.001, F = 168.196, n = 6;B、D为荧光显微镜下ROS阳性细胞数的比较（DHE染色, ×100）, 与对照组比较, *P < 0.001, 与H2O2组比较, #P < 0.001, 与ELA-32组比较, &P = 0.002, F = 491.924, n = 5;E为α-BTX降低Elabela升高的SOD水平, 与对照组比较, *P < 0.001, 与H2O2组比较, #P < 0.001, 与ELA-32组比较, &P < 0.001, F =20.116, n = 5;F为α-BTX升高Elabela降低的MDA水平, 与对照组比较, *P < 0.001, 与H2O2组比较, #P < 0.001, 与ELA-32组比较, &P = 0.013, F = 25.706, n = 5。 |
讨论
MI/R是AMI后死亡的重要原因之一[8]。MI/R是一种由炎症、细胞凋亡和氧化应激等复杂因素引起的心肌损伤。研究发现, Elabela可通过抑制缺氧/复氧（H/R）或MI/R诱导的转化生长因子-β（TGF-β）增加, 保护肾脏免受MI/R损伤[3]。但是Elabela能否减轻MI/R损伤尚不清楚。本研究发现ELA-32可以降低H2O2诱导的H9C2细胞凋亡率, 降低心肌细胞凋亡相关蛋白Bax的产生、心肌细胞凋亡率、ROS阳性细胞数、LDH水平和MDA水平;增加SOD活性和Bcl-2表达, 从而发挥心肌细胞的保护作用。此外, 笔者还发现ELA-32可能部分通过激活α7nAChR/JAK2/STAT3信号通路起到上述有益的作用。
目前, 关于Elabela在心肌缺血中作用的研究都是基于动物模型。Perjés等[2]发现, 动物研究中的假手术组的Elabela表达明显低于心肌缺血组。本研究同样发现, 对照组的血浆Elabela浓度明显低于STEMI组。
LDH是一种广泛应用的心肌损伤标志物。诸多研究发现, MI/R时LDH释放水平明显增加[9-10]。因此, 笔者检测了LDH活性和细胞活力, 用于评估心肌损伤的范围。结果表明, ELA-32预处理改善了H2O2诱导的H9C2细胞LDH活性升高和细胞活力降低, 表明ELA-32对H2O2诱导的细胞损伤具有保护作用。Manzanero（2013年）等发现, 氧自由基在MI/R条件下能够大量产生。MI/R的主要原因是通过有氧代谢产生的ROS[11-12]。Valko（2007年）等认为, ROS是不稳定的化合物, 很容易与蛋白质、DNA反应, 并诱导细胞凋亡, 甚至死亡。因此, 减轻氧化应激和减少氧化产物可能是治疗MI/R的一种途径。在本研究中, 笔者用DHE染色阳性细胞的数量、MDA和SOD来反映H9C2细胞中的氧化和抗氧化水平。结果发现, 经过H2O2处理明显降低SOD水平, 增加MDA水平和DHE阳性细胞, 而用ELA-32预处理则可明显逆转H2O2带来的上述指标的变化。在MI/R过程中, 细胞凋亡在细胞死亡中起着至关重要的作用。最终会导致心功能不全, 甚至死亡[13]。因此, 降低心肌细胞的凋亡率已成为治疗MI/R损伤的有效方法之一。在本研究中, 笔者检测了Elabela对细胞凋亡的影响。结果表明, ELA-32预处理明显降低了Bax水平和Bax/Bcl-2值以及H9C2细胞凋亡率。因此, 笔者得出结论, ELA-32预处理可能通过阻断细胞凋亡途径减轻H2O2损伤。
本研究还存在一些不足。临床研究上, 缺乏关于缺血持续时间、缺血区域范围、冠状动脉疾病程度（1~3支血管疾病）的信息, 也没有动态观察血浆Elabela的浓度变化, 基础研究中也缺乏动物实验, 将来有必要进一步扩大样本量, 完善体内实验, 进一步探索Elabela调节α7nAChR的具体过程。
ELA-32预处理至少部分通过α7nAChR/JAK2/STAT3信号通路对H2O2诱导的心脏损伤发挥保护作用。Elabela可能成为改善MI/R损伤的有效药物。