指甲-髌骨综合征（NPS）又称为遗传性骨甲发育不良，是一种因LMX1B基因突变导致的常染色体显性遗传病，以指甲畸形、髌骨缺失或发育不全、肘部和髂骨背侧发育不良、肾病和成人青光眼为特征[1]。该病极为罕见，临床表型变异度大，容易漏诊或误诊。本研究对1个NPS家系进行了基因测序和遗传学分析，以明确其致病原因，并检索国内外的相关文献进行分析。
对象与方法
一、NPS一家系临床资料的收集
本科于2021年5月17日诊治了1个NPS家系，收集并分析该家系病史、实验室检查及治疗等资料。本研究获本院伦理委员会批准（EC2010-014）。
二、该家系的分子遗传学分析
抽取先证者及父母外周血行家系及胎儿流产组织全外显子测序和Sanger测序验证，对变异结果行生物信息学预测与蛋白结构分析。
1. DNA提取
采集家系成员外周血及胎儿流产组织，采用QLAGEN QIAamp DNA Mini Kit试剂盒（QIAGEN，德国），提取基因组DNA。将所提取的DNA应用微量紫外分光光度计Nano Drop2000 （Thermo Fisher Scientific，美国）测定浓度，合格后冻存于-20℃备用。
2.全外显子组捕获测序检测
以受检者的基因组DNA为检测材料，利用Roche KAPA HyperExome人全外显子组芯片捕获试剂盒（Roche，瑞士）构建文库，使用MGISEQ-2000（华大基因公司，中国）测序平台进行变异检测。人类基因组参考序列版本选择UCSC hg19人类参考基因组。根据2015年颁布的美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）遗传变异分类标准与指南，评判变异的致病性[2]。
3.变异位点的Sanger测序验证
4.生物信息学预测与蛋白结构分析
在UCSC网站（http://www.genomaize.org/）上查询LMX1B蛋白在不同物种间的保守性。在alphafold网站（https://alphafold.ebi.ac.uk/）下载合适的人类蛋白结构模型[O60663 （LMX1B_HUMAN）]，采用PyMOL2.5软件预测变异对蛋白空间结构的影响。
三、文献检索
以“指甲-髌骨综合征”“产前诊断”“nail-patella syndrome”“prenatal diagnosis/antenatal diagnosis”为检索词，对以下数据库截至2022年12月收录的论文进行检索：PubMed、中国生物医学文献服务系统（SinoMed）、CNKI、万方数据知识服务平台、维普中文科技期刊数据库，收集并分析检索到的NPS患者资料。
结果
一、NPS一家系的病历资料
1.入院主诉及检查
孕妇，39岁，孕3产1，孕23+2周时因“外院产前超声检查提示胎儿双足内翻”于2021年5月12日到本院产前诊断门诊就诊，复查产科超声提示胎儿双足内翻，见图1A。临床医师推荐患者于2021年5月17日到本科就诊。孕妇曾生育1女，现7岁，体格检查发现其行走姿势呈“外八字”，双手指甲发育不良，发育不良程度由拇指至小指依次减轻，大拇指指甲缺失，双足指甲发育尚可，见图1B，该患儿在宫内超声检查时即已发现“双足内翻”，当时向临床医师咨询后，孕妇及家属决定继续妊娠。患儿于2018年3月16日足月顺产娩出，出生时其双足内翻，余未见明显异常。基于当时基因测序技术普及率不高，故未行基因检测。患儿出生1个月曾于外院行双足内翻矫正手术，效果尚可，但行走姿势仍呈“外八字”。详询家系成员情况，患儿父亲存在与女儿相似的双手指甲异常表现，且双手手指存在因近端关节过度拉伸和远端关节过度屈曲而形成的“天鹅颈样”畸形，左手无名指、右手食指中指及无名指末节指间关节指纹消失，见图1C。家系成员发病情况见图1D。由于年限、家庭经济等多方面原因，该家系的部分相关资料丢失，信息不全。
图1 NPS一家系相关检查结果注：A为胎儿超声检查，提示双足内翻；B为先证者双手指甲发育不良外观，发育不良程度由拇指至小指依次减轻，大拇指缺如，双足趾甲发育尚可；C为先证者父亲双手存在与先证者表现一样的指甲发育不良，双手手指因近端关节过度拉伸和远端关节过度屈曲而形成“天鹅颈样”畸形，左手无名指、右手食指中指及无名指末节指间关节指纹消失；D为该NPS家系图；E为Sanger测序结果，先证者和流产胎儿组织均存在LMX1B基因c.736C>T （p.Arg246*） 杂合突变，遗传自表型异常的父亲；F为不同物种间蛋白保守性，显示LMX1B第246位精氨酸（红色方框位置）为高度保守氨基酸；G为LMX1B蛋白空间结构预测结果，为野生型（WT）；H为变异型（Mutated）。 |
2.诊断及确诊过程
结合家系患者现有表型，并查阅骨骼异常文献资料，疑诊胎儿患NPS，经咨询后，孕妇及家属决定终止妊娠，流产胎儿外观显示双足姿势异常。继续采集家系成员外周血及胎儿流产组织行全外显子测序及Sanger测序验证，以明确遗传学病因。所有受检者对上述检测知情并签署知情同意书。
3.全外显子测序及Sanger测序验证结果
家系全外显子测序及Sanger验证发现先证者与流产胎儿组织均存在LMX1B基因第4号外显子的c.736C>T （p.Ar g246*） 杂合突变，遗传自表型异常的父亲，见图1E。依据ACMG遗传变异分类标准与指南，该突变为致病突变（ACMG： PVS1+PM2+PP4）。经检索Human Gene Mutation Database数据库，确定为已报道的致病突变。
4.生物学信息预测
在UCSC网站（http://www.genomaize.org/）上查询LMX1B蛋白第246位氨基酸位点在人类、鼠、狗、鸡、斑马鱼等物种间的蛋白保守性，结果提示LMX1B蛋白第246位氨基酸位点在不同物种间高度保守，见图1F。c.736C>T （p.Arg246*）突变导致LMX1B蛋白翻译提前终止，生成截短的LMX1B蛋白，蛋白结构预测提示，p.Arg246*突变改变了蛋白空间结构，影响蛋白功能，见图1G~H。
二、文献检索结果
收集到产前诊断为NPS的病例共6例，均经超声检查和（或）分子遗传学分析明确诊断，6例的临床资料见表1。
表1 产前诊断为NPS的病例统计 |
| 序号 | 第一作者 | 诊断方法 | 诊断孕周/周 | 产前表型 | 有家族史 | 临床结局及表型 | 基因检测结果 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | McIntosh[6] | 分子遗传学分析 | 11 | 无描述 | 是 | 15周终止妊娠 | c.750+1G>A |
| 2 | Feingold[8] | 超声检查 | 36 | 双侧髂骨角 | 是 | 活产；指甲发育不良；双侧髂骨角 | 无描述 |
| 3 | Pinette[9] | 超声检查 | 18~19 | 左侧膝关节缺如，左下肢杵状畸形伴旋转不良 | 是 | 活产；双侧髌骨缺如，股骨颈外翻畸形，左脚脚尖畸形 | 无描述 |
| 4 | Sweeney[10] | 超声检查 | 20 | 双足内翻 | 未知 | 无描述 | 无描述 |
| 5 | Padmanabhan[11] | 超声检查 | 20 | 双侧肢体运动受限伴下肢旋转不良 | 是 | 终止妊娠；流产胎儿检查发现腓骨内转、肘关节屈曲、膝关节生长受限、双足内翻 | 无描述 |
| 6 | 崔玥[12] | 超声检查+分子遗传学分析 | 24 | 双侧膝关节后翻，右足呈摇椅状，右手呈内翻 | 是 | 无描述 | c.139+1G>T |
讨论
NPS的典型临床表现为涉及指甲、骨盆、膝关节、肘关节的四联畸形，除此之外，还存在眼部和肾脏受累的表现[1]。指甲缺失/发育不良是NPS最恒定的特征，几乎所有的患者均存在指甲受累的情况。骨骼异常主要包括骨关节的发育不良及脱位、足部内/外翻畸形。其中，手指关节可因近端关节过度拉伸和远端关节过度屈曲而形成“天鹅颈样”畸形；髂骨后部形成的三角形骨隆起物称为“髂骨角”，被认为是NPS的特征性病变。眼部异常较为少见，表现为青光眼、视网膜色素异常等。肾脏病变是NPS最严重的表现，可从轻微血尿、蛋白尿发展到肾衰竭。由于NPS临床表现变异度大，症状在同一家庭成员之间也可能不尽相同，因此临床医师需告知患者各类疾病发生风险的可能性，完善相关检查，并定期检测。
1998年，Vollrath等[3]通过测序技术确定了LMX1B基因功能缺损为NPS的致病原因。LMX1B位于9q34，包含8个外显子，编码LIM同源结构域蛋白家族转录因子，是一种由379个氨基酸组成的高度保守蛋白质，对维持背侧肢体、肾小球基底膜、眼睛前段和神经元的发育起重要作用[4]。该蛋白质主要包括2个结合DNA的LIM结构域（LIM-A、LIM-B）及一个结合蛋白的同源结构域。目前已经报道了180多种（https: //www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.php）LMX1B致病突变，80%的突变位于LIM域，20%位于同源域，主要包括单核苷酸变异和基因缺失/插入。尽管NPS的肾外症状没有明显的基因型-表型关联，但据报道，与携带LIM域突变的患者相比，具有同源域内LMX1B突变的患者出现蛋白尿的频率明显增高[5]。
本研究通过全外显子测序及Sanger测序验证发现先证者、先证者父亲和流产胎儿均携带相同的LMX1B基因c.736C>T（p.Arg246*）杂合突变，为已知的致病突变，且先证者的临床表型也与NPS的典型表型一致。有研究者曾报道过1例存在c.736C>T新发杂合突变的患者，其具有典型的NPS临床表型：指甲发育不良，肘部僵硬、伸展受限，髌骨及髂骨畸形，眼部及肾脏未见异常[6]。c.736C>T位于LMX1B基因同源结构域，氨基酸保守性分析显示246位氨基酸在不同物种中高度保守（http：//www.genomaize.org/）。该突变使246位的精氨酸变为终止密码子，导致截短蛋白形成，影响LMX1B蛋白功能，从而引起NPS的相关症状。Sasidharan等[7]在1个7日龄的NPS男性患儿中发现LMX1B的4号外显子c.691C>T， （p. Arg231Ter） 无义突变，该突变也位于LMX1B基因同源结构域，这也再次说明了LMX1B基因同源结构域对维持其蛋白功能的重要性。
既往报道的NPS病例大多数于出生后才被诊断，产前诊断为NPS的仅6例[6,8⇓⇓⇓-12]。其中5例产前超声检查均提示足内翻/肢体运动受限/长骨畸形等骨骼异常，并且均有家族史，1例因产前绒毛基因检测发现LMX1B的c.750+1G>A突变，故直接于孕15周引产。Drut等[13]发现了1例18周自然流产胎儿的肾脏出现病理变化，肾小球超微结构检查显示其肾小球和系膜毛细血管壁增厚，基底膜不规则增厚，由此他们提出通过宫内肾活组织检查辅助产前诊断NPS。但鉴于实施胎儿宫内肾穿刺存在高风险，因此宫内肾活组织检查未被用于诊断NPS。Feingold等[8]曾提出可在孕36周时通过超声检查显示髂骨角来诊断胎儿NPS。上述分析显示，NPS患者孕中期超声检查显示足内翻/肢体运动受限/长骨畸形等骨骼异常概率较高，因此产前超声检查显示骨骼异常合并家族指甲及骨骼异常疾病史时，临床医师需提高警惕，及时进行产前诊断以明确是否为NPS。目前NPS的诊断方法为依据患者表型联合基因检测，推荐全外显子测序检测方法。如果基因测序不能诊断，但临床怀疑NPS并观察到显性遗传模式，则可以考虑是否存在因LMX1B基因倒置而干扰LMX1B基因功能的可能性[14]。在治疗方面，NPS暂无有效的治疗方法，只能对症支持治疗，骨骼问题可选择物理治疗或者手术，肾脏异常可使用ACEI控制血压和减缓蛋白尿的进展，并应进行定期监测。
本研究通过全外显子测序和Sanger测序技术明确了LMX1B基因c.736C>T（p.Arg246*）杂合突变为该家系的致病原因，丰富了中国人群LMX1B基因突变所致的NPS突变谱和表型谱，为家系的遗传咨询和再生育指导提供了依据。