EB病毒（EBV）是一种常见嗜人类淋巴细胞的疱疹病毒，人类普遍易感，在全球约90%的人口中造成了终身感染[1]。原发性EBV感染常在儿童和青少年中发生，多表现为隐性感染和传染性单核细胞增多症（IM）[1]。部分患儿会出现气道损伤、脾破裂、肝衰竭等严重并发症而危及生命[2]。维生素D是儿童生长发育过程中所需要的营养素，也在机体免疫调节及抗感染中具有重要的作用[3]。研究表明机体维生素D水平降低可增加IM的患病风险[4]。Zwart等（2011年）的研究显示，补充维生素D可以阻止EBV的再激活。25-羟维生素D[25（OH）D]半衰期长、稳定性高，是人体血液中维生素D的主要形式，能较好地反映机体维生素D水平[5]。目前国内外尚没有关于儿童体内维生素D水平与IM的相关报道。由此，本研究探讨了IM患儿血清25（OH）D水平及其与异型淋巴细胞、肝功能的相关性。
对象与方法
一、研究对象
纳入2021年3月至2022年3月在杭州师范大学附属医院儿科住院治疗的被确诊为EBV感染致IM的90例患儿为IM组，选择同期在该院儿童保健门诊体检的40名健康儿童为对照组。本研究已通过杭州师范大学附属医院伦理委员会的审批（2022 E2-KS-113）。
二、诊断标准
纳入标准：①符合《儿童EB病毒感染相关疾病的诊断和治疗原则专家共识》中IM的诊断依据；②临床资料完整；③近期无其他病毒感染[6]。排除标准：①曾服用过肝损伤相关药物；②既往有IM及重症EBV感染病史；③检验前4周补充过钙或维生素D；④伴维生素D代谢性疾病，如甲状旁腺功能亢进症。
三、样本的采集和检测指标
抽取IM组入院第1日（对照组体检当日）的静脉血，进行血常规、外周血异型淋巴细胞计数、肝功能、血浆EBV-DNA、25（OH）D等指标的检测。采用电化学发光法检测25（OH）D的水平，检测仪器为电化学发光免疫分析仪，配套试剂盒生产厂家为德国罗氏公司。25（OH）D正常参考值范围：25 nmol/L≤25（OH）D < 50 nmol/L为维生素D缺乏；50 nmol/L≤25（OH）D < 75 nmol/L为维生素D不足；25（OH）D≥75 nmol/L为维生素D充足[7]。将25（OH）D不足与缺乏统称为维生素D不充足，此类患儿被纳入不充足亚组，反之则被纳入充足亚组。采用实时荧光定量PCR技术测定血浆EBV-DNA载量，检测仪器为上海宏石医疗科技有限公司SLAN-96S实时荧光定量PCR系统，所用DNA提取及核酸扩增荧光定量检测试剂盒生产厂家为湖南圣湘生物科技股份有限公司。
四、统计学处理
使用SPSS 25.0处理数据。计量资料通过Shapiro-Wilk进行正态性检验，服从正态及近似正态分布的数据以表示，在方差齐时进行独立样本t检验；非正态分布数据以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例（%）表示，组间资料比较采用χ 2检验。指标相关性采用双变量相关分析，正态资料使用Pearson相关分析，非正态分布资料采用Spearman秩相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、一般资料
IM组与对照组的年龄分别为4.67（3.18，6.00）岁和4.75（2.48，6.38）岁，男女性别比例分别为46/44和17/23，均具可比性（P均 > 0.05）。
二、IM组与对照组血清25（OH）D水平及不充足率比较
IM组血清25（OH）D水平低于对照组，25（OH）D不充足率高于对照组（P均 < 0.05）。见表1。
表1 IM组与对照组25（OH）D水平和不充足率的比较 |
| 组 别 | 25（OH）D/（nmol/L） | 维生素D不充足/例（%） |
|---|---|---|
| IM组（90例） | 80.68（59.30，109.53） | 40（44.4） |
| 对照组（40例） | 95.82（80.72，148.20） | 8（20.0） |
| Z/χ²值 | -3.087 | 7.105 |
| P值 | 0.002 | 0.008 |
三、IM组血清25（OH）D不同水平与肝功能指标及血浆EBV-DNA载量的比较
IM组中的不充足亚组的异型淋巴细胞计数、ALT、AST、 谷酰转肽酶（GGT）和腺苷脱氨酶（ADA）水平均多/高于充足亚组，而胆碱酯酶（ CHE）水平低于充足亚组（P均< 0.05）。充足亚组及不充足亚组的总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）及血浆EBV-DNA载量比较差异无统计学意义（P均 > 0.05）。见表2。
表2 IM患儿血清25（OH）D不同水平与肝功能指标及血浆EBV-DNA载量的比较 |
| 项 目 | 充足亚组（50例） | 不充足亚组（40例） | Z/t值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 异型淋巴细胞计数/（×109/L） | 7.00（5.00，10.50） | 10.00（7.00，16.00） | -2.478 | 0.013 |
| ALT/（U/L） | 27.00（14.75，64.25） | 47.50（27.00，85.25） | -2.388 | 0.017 |
| AST/（U/L） | 46.00（36.75，63.25） | 55.50（44.50，92.75） | -2.567 | 0.010 |
| GGT/（U/L） | 12.50（10.00，23.50） | 19.00（13.25，40.50） | -2.821 | 0.005 |
| ADA/（U/L） | 37.75（24.35，51.80） | 54.60（42.00，74.70） | -3.862 | 0.001 |
| CHE/（U/L） | 8 082.70±1 902.68 | 7 184.68±1 387.04 | 2.500 | 0.014 |
| TBIL/（μmol/L） | 5.72±2.21 | 5.95±2.70 | -0.453 | 0.652 |
| DBIL/（μmol/L） | 1.20（0.80，1.43） | 1.15（0.90，1.78） | -1.103 | 0.270 |
| 血浆EBV-DNA载量/（copies/mL） | 1965.00（736.75，5197.50） | 3620.00（680.25，6477.50） | -0.311 | 0.756 |
四、IM患儿血清25（OH）D水平与肝功能指标及异型淋巴细胞的相关性分析
IM患儿血清25（OH）D水平与ALT、GGT、ADA及异型淋巴细胞均呈负相关，与CHE呈正相关（P均 < 0.05），与AST、TBIL及DBIL无线性相关关系（P均 > 0.05）。见表3。
表3 IM患儿血清25（OH）D水平与肝功能指标及异型淋巴细胞相关性分析 |
| 项 目 | CHE | TBIL | DBIL | ALT | AST | GGT | ADA | 异型淋巴细胞计数 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| r/rs | 0.314r | -0.148r | -0.058r | -0.238rs | -0.188rs | -0.340rs | -0.425rs | -0.317rs |
| P值 | 0.003 | 0.164 | 0.589 | 0.024 | 0.075 | 0.001 | 0.001 | 0.002 |
讨论
近年来维生素D在感染反应中的免疫调节功能受到广泛关注。维生素D可以促进抗菌肽的生成，包括防御素和cathelicidin，人cathelicidin被称为LL-37，具有抑制病毒复制的作用[8]。此外，维生素D是一种直接作用于免疫系统的激素，可抑制促炎细胞因子的分泌，促进抗炎细胞因子的产生，减轻炎症反应[9]。维生素D缺乏会增加病毒或其他微生物的易感性[10]。在机体感染EBV时，维生素D能提高调节性T细胞（Treg）抑制T淋巴细胞增殖的能力，抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖和细胞因子的产生，可将原发性EBV感染控制在亚临床水平状态，这种保护机制的失调可能导致IM的发生[11⇓-13]。Zwart等（2011年）对南极工作者定期补充维生素D，发现其中血清25（OH）D水平较高的受试者不太可能通过唾液排出EBV。Yenamandra等（2010年）发现EBV蛋白核抗原-3（EBNA3）与维生素D受体（VDR）位于同一蛋白质复合体中，EBNA3可以在基础水平上阻断（或下调）VDR依赖基因的激活。EBV可能通过阻断VDR的作用导致维生素D缺乏。可见，维生素D与EBV之间存在相互作用。Maghzi等（2016年）发现成人IM患者维生素D水平明显低于健康组。Lossius等（2014年）在研究不同纬度地区IM的季节和多发性硬化的发病风险时发现，IM的发生可能与紫外线照射不充足致使维生素D合成不足有关。本研究与上述研究结论一致：IM组的血清25（OH）D水平低于对照组、25（OH）D的不充足率高于对照组，这可能是由于IM患儿的维生素D缺乏增加了EBV的活跃度，或EBV的活跃度影响了维生素D的吸收。
感染EBV时，EBV会攻击B淋巴细胞，B淋巴细胞抗原性改变，T淋巴细胞被激活转化为以CD8+T细胞为主的细胞毒性T细胞，从而杀伤感染EBV的B淋巴细胞，这种具有杀伤能力的T淋巴细胞就是患儿血中的异型淋巴细胞。研究表明，维生素D对T淋巴细胞有直接和间接的影响，且CD8+ T细胞和恒定自然杀伤T细胞（iNKT）是维生素D的靶细胞，提示低维生素D状态可能增强CD8+ T细胞在EBV感染细胞时的免疫应答[14]。结合本研究结果，25（OH）D与异型淋巴细胞呈负相关，提示25（OH）D可能参与IM患儿的发病过程。
肝损伤是IM常见的并发症。而维生素D对肝损伤具有保护作用，维生素D可通过抗炎与免疫调节等特性来抑制肝脏炎症及氧化应激等病理变化的发生发展，从而减缓急慢性肝损伤的进程[15-16]。在诱导形成的小鼠肝损伤模型中可发现，维生素D长期缺乏会加重小鼠的肝损伤程度，而补充维生素D能显著降低小鼠模型血清ALT、AST水平，由于维生素D能抑制炎症反应及氧化应激，因此能减轻小鼠肝损伤模型的肝组织细胞受损和坏死程度[17-18]。ALT、AST、GGT、ADA及CHE等能较全面地反映肝功能状态，TBIL及DBIL等可反映胆红素代谢及胆汁淤积的状态，其中ALT是测定肝功能异常的最直接指标。在本研究中，IM患儿不充足亚组的ALT的水平高于40 U/L，且AST、GGT及ADA水平均高于充足亚组，提示IM患儿在维生素D不充足的情况下，其肝细胞受损或坏死的数目可能会增多。相关性分析也提示25（OH）D水平与肝功能指标有一定的相关性。感染EBV时，病毒并非直接损害肝细胞，EBV感染激活的CD8+T细胞被肝脏捕获，肝Kuppfer细胞表达干扰素（IFN）-γ、TNF-α等可溶性分子导致肝脏出现免疫损伤[19]。1，25-双羟维生素D[1，25-（OH）2D]能抑制CD8+T细胞刺激产生的IFN-γ和TNF-α以减轻肝损伤，提示维生素D可能通过调节免疫反应缓解IM患儿的肝损伤，但目前相关研究甚少[20]。此外，本研究显示尽管比较差异无统计学意义，但不充足亚组的血浆EBV-DNA载量稍高于充足亚组，考虑样本量较少有可能造成一定的影响，因此未来仍需要进行更多的大样本研究来深入探索。
综上所述，IM患儿存在血清维生素D水平低的情况，维生素D可能在参与IM患儿病程的发生发展中发挥着重要作用，维生素D水平低可能与肝损伤程度加重有关。