吡嗪酰胺（PZA）是目前唯一可杀灭巨噬细胞内结核分枝杆菌的关键一线抗结核药物，其耐药问题严峻而其耐药机制尚未完全阐明[1]。已有的研究表明PZA作为前体药物，在pncA基因编码的吡嗪酰胺酶催化作用下发挥抗结核作用，pncA基因突变则是结核分枝杆菌PZA耐药的主要机制，但pncA无热点突变区[2⇓⇓-5]。此外研究表明部分PZA耐药结核分枝杆菌未发生pncA基因突变，甚至其PZA酶仍有活性，提示pncA突变并非结核分枝杆菌PZA耐药的唯一机制[6-7]。Sheen等[8]研究发现在pncA野生型PZA耐药菌株中观察到与pncA启动子区域突变相关的低水平pncA表达，在pncA突变型PZA耐药菌中pncA基因表达水平如何，pncA基因表达是否为pncA基因突变以外的结核菌PZA耐药机制之一?目前尚无明确的研究表明pncA的表达是否会影响结核分枝杆菌的PZA耐药，本研究旨在通过分析PZA耐药的耐多药结核分枝杆菌pncA在PZA刺激前后菌株pncA基因表达情况，探讨pncA表达在结核分枝杆菌PZA耐药中是否发挥作用。
材料与方法
一、材料
1.结核分枝杆菌
试验所用结核分枝杆菌来自广州市胸科医院分枝杆菌样本库，菌株入库前均已通过生化和分子方法鉴定为结核分枝杆菌且通过临床药敏诊断实验鉴定为耐多药（同时对异烟肼和利福平耐药），且经MGIT 960系统检测其PZA药敏性。
2.试剂与仪器
Middlebrook 7H9/7H10 培养基购自美国BD公司、PZA购自美国Sigma公司、TRIzol（200 mL）、逆转录试剂盒（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits）和荧光定量PCR 试剂盒为美国Thermo有限公司产品。细菌超声分散仪BAC spreaderTM 1100[体必康生物科技（广东）股份有限公司]、MP Fastprep-24 5G 快速样品制备仪（美国MP Biomedicals）、超微量紫外分光光度计（美国Thermo）、荧光定量PCR仪ABI Vin7（美国ABI）。
二、方法
1.结核分枝杆菌复苏
从分枝杆菌菌种库中取出结核分枝杆菌，37 ℃孵箱孵育过夜后转种于7H10米氏固体培养基，37 ℃培养3~4周。刮取培养基斜面菌落，细菌超声分散仪调整浓度至1麦氏。以1×106/mL终浓度接种于pH为7.0的7H9/10米氏培养基、PZA浓度为0和50 μg/mL且pH为5.8的7H9米氏液体培养基。固体培养基上结核分枝杆菌培养4周后阿尔玛蓝显色法检测目标菌株利福平和PZA的最小抑菌浓度（MIC），PZA刺激培养组培养2周后提取RNA。
2.利福平和PZA的MIC检测
取pH为7.0的7H9/10米氏固体培养基斜面上生长至对数生长期的结核分枝杆菌，细菌超声分散仪调整浓度至1麦氏，以1×105/mL终浓度接种于含PZA终浓度为0、50、100、200、400、800、1 600 μg/mL的96孔板中（每孔200 μL，pH 5.8，7H9米氏液体培养基）；以1×106/mL终浓度接种于含0.015 265、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、64、128、256、512 μg/mL利福平的96孔板中（每孔200 μL，pH 7.0，7H9米氏液体培养基）培养14 d后每孔加入30 μL终浓度为0.2%的刃天青，37 ℃培养72 h后观察显色发现，培养液由蓝色变为玫红色指示结核分枝杆菌生长。
3. RNA提取
对数生长期的培养菌液8 mL，以10 000 r/min离心5 min后弃上清，加入1 mL TRIzol 液体后颠倒混匀后转移至裂解介质管中，并置于MP快速样品制备仪。快速振荡30 s后冰浴 2 min，重复4次。于4 ℃ 10 000 r/min离心15 min后取上清至RNase-free 1.5 mL EP管，加入200 μL氯仿后颠倒混匀，室温静置5 min。4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，上层液体转移至新的RNase-free 1.5 mL EP管中，加600 μL异丙醇、60 μL 3 mol/L NaAc （pH 5.3）、10 μL glogen后于-70 ℃条件过夜。次日复融后，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min后弃上清，加入1 mL 75% 乙醇重悬，在4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，轻柔弃去液滴后自然干燥 5 min，加入50 μL RNase-free 水溶解。取1 μL RNA 样品检测浓度，调整浓度后取10 μL样品逆转录为cDNA。
4.检测pncA基因表达
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）扩增pncA基因，pncA引物为：上游5′-GGTGTTCTACAAGGGTGCCT-3′，下游5′-GGTGGCAATACCGACCACAT-3′，内参基因为rrs，测得pncA基因的Ct值。相对定量2-ΔΔCt 法计算pncA基因相对表达量。
三、统计学处理
数据录入Excel表格，以SPSS 26.0、GraphPad软件进行统计分析及绘图。根据试验菌株pncA基因的Ct值计算相对表达量（2-ΔΔCt）。本研究数据经Shapiro-Wilk（W检验）正态性检验显示数据为非正态分布，以M（P25，P75）予以统计描述，PZA刺激前后结核分枝杆菌pncA基因表达水平对比采用符号秩和检验，多组比较采用 Kruskal-Wallis 秩和检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、PZA耐药水平分析
38株PZA耐药的耐多药结核分枝杆菌，经MIC检测显示：>1 600 μg/mL者9株、1 600 μg/mL者12株、800 μg/mL者6株、400 μg/mL者6株、200 μg/mL者2株、100 μg/mL者3株。定义PZA的MIC≥1 600 μg/mL为PZA高水平耐药、400~800 μg/mL为中等水平耐药、100~200 μg/mL为低水平耐药，将PZA耐药菌分为3组。
二、RFP耐药水平分析
PZA高、中、低水平耐药的3组菌株利福平的MIC经Shapiro-Wilk （W检验）正态性检验显示P < 0.001，提示数据为非正态分布。PZA高、中、低水平耐药菌株利福平的MIC分别为128 （64，128）、128（64，128）、64（18，96） μg/mL。PZA高、中、低水平耐药组结核分枝杆菌利福平耐药状况示意图见图1。Kruskal-Wallis 秩和检验比较PZA高、中、低水平耐药组利福平的MIC比较差异无统计学意义（P = 0.203）。
三、pncA本底表达水平检测
以荧光定量 PCR 检测菌株pncA基因和内参基因rrs的Ct值，2株耐多药PZA敏感菌株为对照（Ct平均值为15.49），计算相对表达值（2-ΔΔCt）。pncA基因相对表达值经Shapiro-Wilk（W检验）正态性检验显示P < 0.001，提示其为非正态分布。PZA高、中、低水平耐药结核菌pncA本底表达分别为0.904（0.202，2.653）、1.157（0.658，1.511）、1.147（0.372，1.347），pncA本底表达情况见图2。Kruskal-Wallis 秩和检验对比PZA耐药水平不同组之间pncA基因表达水平比较差异无统计学意义（P = 0.731）。
四、PZA药物处理前后结核分枝杆菌的pncA表达差异分析
以pH 5.8的7H9米氏培养基培养菌株为对照，以pH 5.8的50 μg/mL PZA含药7H9米氏培养基培养菌株为实验组，计算相对表达值（2-ΔΔCt）。pncA基因相对表达值经Shapiro-Wilk（W检验）正态性检验显示P < 0.001，提示数据为非正态分布。PZA高、中、低水平耐药菌株在PZA药物刺激下的相对表达值分别为1.516（0.654，3.319）、0.846（0.421，1.237）、0.726（0.225，3.017）。见图3。Kruskal-Wallis 秩和检验对比PZA耐药高、中、低水平组在PZA药物刺激下组间pncA基因表达水平，差异无统计学意义（P = 0.120）。符号秩和检验菌株PZA药物刺激前后pncA基因表达水平比较差异无统计学意义（P = 0.249）。见图4。
讨论
已有的研究表明pncA基因突变是结核分枝杆菌PZA耐药的主要机制，而高达30%的PZA耐药菌表现出PZA酶活性且拥有野生型pncA基因，提示pncA基因突变以外PZA耐药机制的存在[9⇓⇓-12]。前期对所纳入研究的结核分枝杆菌进行pncA测序，同时检测到pncA突变型和野生型。此外我们前期研究还在耐多药PZA敏感结核分枝杆菌中检测到pncA基因突变，也表明pncA基因突变不足以单独解释结核分枝杆菌PZA耐药。pncA基因编码吡嗪酰胺酶催化PZA发挥抗结核作用，在PZA耐药结核分枝杆菌中其表达状况如何，pncA基因低水平表达是否为pncA基因突变外结核分枝杆菌PZA耐药机制?本研究聚焦此问题，主要通过对比分析PZA耐药结核分枝杆菌经PZA药物刺激后pncA基因表达与无PZA药物刺激时本底表达之间的差异。
因PZA耐药主要发生在耐多药结核分枝杆菌中，非耐多药结核患者 PZA 耐药率较低[12⇓⇓⇓⇓⇓-18]。故本研究以耐多药PZA耐药结核分枝杆菌为研究对象，检测菌株PZA的耐药水平并定义了其高、中、低。结核分枝杆菌利福平耐药主要由rpoB基因突变引起，rpoB 基因编码RNA聚合酶β亚基，其突变引起的RNA聚合酶β亚基结构的改变可能会影响下游RNA转录和蛋白质的翻译。而PZA为前体药物经pncA基因编码的 PZA酶催化发挥抗结核作用，是否会受到利福平耐药的影响?为解答这一问题，我们首先检测了PZA耐药高、中、低水平组菌株利福平耐药水平，结果显示3组利福平的MIC中位数均超过64 μg/mL，为较高水平耐药。对比PZA高、中、低水平耐药组之间利福平耐药水平，结果显示无差异。考虑原因可能为本研究86.84%（33/38）的菌株利福平MIC超过32 μg/mL，即PZA耐药菌株多为利福平较高水平耐药。耐多药菌株较高水平的利福平耐药是否会影响到pncA基因的表达水平?本研究检测了PZA药物刺激结核分枝杆菌相对于无药刺激组的表达水平，并将其与菌株pncA基因本底表达（pH 7.0的7H10米氏固体培养基）水平对比，发现PZA高、中、低水平耐药组接受PZA药物刺激后pncA基因的表达与本底表达无明显差异。PZA耐药结核分枝杆菌在PZA药物作用下pncA基因表达未发生变化，pncA基因低水平表达是否为结核分枝杆菌PZA耐药的可能机制需要进一步深入研究。关于pncA基因表达的研究，Rueda等[19]研究提示，11株pncA基因突变菌中2株呈现相对低水平pncA表达、9株pncA基因表达水平升高。与本研究所不同的是，其pncA表达为体外构建质粒载体表达，本研究直接检测结核分枝杆菌临床分离株pncA基因的表达与其略有不同。此外，我们对4例PZA敏感一线抗结核药物全敏结核分枝杆菌同样进行PZA药物刺激试验，结果发现PZA刺激后其pncA基因表达有3倍及以上的升高。