冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）是一种常见的心血管疾病，是全球非传染性疾病中死亡的首要原因[1]。我国CHD患者已达到1139万，CHD已成为中国人群的第2位死亡原因，给我国居民健康造成严重威胁[2-3]。因此，寻找影响CHD的干预靶点，对于提升CHD患者的临床救治质量有重要价值。在CHD的早期阶段，内皮血管平滑肌黏附分子和炎症细胞因子例如IL-6、TNF-α表达增加，发生CHD病变的患者血管系统普遍处于炎症状态[4-5]。早期生长反应因子3（Egr3）是一种转录因子，对于炎症反应至关重要[6]。有研究证实，敲低Egr3基因可减弱人原代内皮细胞的生长、迁移和血管形成、单核细胞黏附和组织因子活性，Egr3基因会引起血管病理性再生、炎症及动脉硬化[7-8]。本研究旨在评估Egr3在临床实践中作为CHD患者病情严重程度指标的实用价值。
对象与方法
一、研究对象
本研究为病例对照研究，利用PASS 12.0软件计算样本量，得到样本量为120例，每组样本至少40例。收集2022年6至12月在我院就诊，表现为CHD症状的患者573例，均完善冠状动脉造影检查。符合CHD造影诊断标准的患者138例，根据Gensini评分的中位数（36分）和造影结果将CHD患者分成2组：轻度狭窄组（<36分，n=66）和重度狭窄组（≥36分，n=72）。另取同期冠状动脉造影结果正常的患者为对照组，共47名。纳入标准：①年龄≥18岁；②CHD的确诊是经冠状动脉造影检查证实冠状动脉至少存在一支血管腔狭窄程度≥50%[9]。排除标准：①存在精神疾病；②急慢性感染；③存在严重瓣膜性心脏病、心肌病、心肌炎、肺源性心脏病、先天性心脏病、心源性休克等病史；④既往或现在有恶性肿瘤病史；⑤肝肾功能不全、近期有创伤、手术史；⑥血液病、自身免疫系统疾病；⑦对造影剂过敏者。本研究按照《赫尔辛基宣言》进行，并获得本院医学伦理委员会批准（批件号：XYDWFYLSH-2022-042），研究对象均签署了知情同意书。
二、观察指标与检测方法
1.收集和计算患者入院后的基线资料
一般资料：性别、年龄、血压、BMI和吸烟史。既往病史：高血压、糖尿病。各项血液生化指标：白细胞、尿酸、尿素氮、血肌酐、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、LDL、HDL、GHbAlc、脂蛋白、Egr3、IL-6、TNF-α水平。
2. Egr3、IL-6、TNF-α检测方法
将受试者在冠状动脉造影时，行冠状动脉取血2 mL，室温静置30 min后以1 500 r/min的转速离心10 min，取上清液保存于-80℃ 环境下。采用ELISA方法检测血清中炎症细胞因子，试剂盒Egr3（货号JL38299）、IL-6（货号JL14113）、TNF-α（货号JL10208）操作步骤严格按照（上海酶联生物科技有限公司）说明书进行；采用酶标仪（型号 K6600A，北京凯奥科技发展有限公司）在450 nm波长处测OD值。
3.冠状动脉造影结果分析
评估冠状动脉造影结果，将冠状动脉分成14段，利用Gensini评分方法将狭窄程度和病变位置赋分。冠状动脉狭窄程度赋分：冠状动脉狭窄程度1%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为4分，76%~90%为8分，91%~99%为16分，100%狭窄为32分。权重系数依据冠状动脉病变不同位置确定：左主干×5，左前降支近段或回旋支近段×2.5，前降支中段×1.5，前降支远段×1.0，回旋支中、远段×1.0，右冠状动脉、左心室后侧支×1.0，钝缘支动脉、第一对角支、心尖支×1.0，第二对角支×0.5[10]。冠状动脉狭窄程度总分是病变位置得分乘以相应系数，是所有病变分支得分的总和。
三、统计学处理
用SPSS 26.0进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用$\bar{x}±s$表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。非正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，组间比较使用Kruskal-Wallis H秩和检验，两两比较采用Bonferroni法，调整P值为0.017（0.05/3）。计数资料以例（百分比）[n（%）]进行描述，比较采用χ 2检验及Fisher确切概率法；Egr3与炎症指标、临床指标的相关性采用Pearson相关性分析；绘制受试者操作特征（ROC）曲线分析Egr3、IL-6和TNF-α对CHD的预测价值。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、对照组、轻度狭窄组、重度狭窄组的基线资料比较
对照组、轻度狭窄组、重度狭窄组患者的一般资料和临床资料比较，见表1。3组的高血压史、白细胞、尿素氮、血肌酐、空腹血糖、GHbAlc、舒张压比较差异均有统计学意义（P均< 0.05）。其中重度狭窄组及轻度狭窄组白细胞、GHbAlc水平高于对照组，差异均有统计学意义（P均< 0.017）。
表1 对照组、轻度狭窄组、重度狭窄组的基线资料比较 |
| 临床特征 | 对照组（47名） | 轻度狭窄组（66例） | 重度狭窄组（72例） | F/ χ 2/H值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 男性/例（%） | 21（44.68） | 36（54.55） | 48（66.67） | 5.805 | 0.055 |
| 吸烟史/例（%） | 15（31.91） | 21（31.82） | 30（41.67） | 1.850 | 0.398 |
| 高血压史/例（%） | 20（42.56） | 50（75.76）a | 45（62.50）a | 12.870 | 0.002 |
| 糖尿病史/例（%） | 10（21.28） | 27（40.91） | 24（33.33） | 4.790 | 0.091 |
| 年龄/岁 | 58.96±8.08 | 62.74±10.05 | 62.47±11.74 | 4.335 | 0.114 |
| BMI/（kg/m2） | 25.99±3.35 | 25.43±2.84 | 25.43±3.16 | 0.560 | 0.572 |
| 白细胞/（×109/L） | 5.94（4.70，6.60） | 6.68（5.91，7.94）a | 6.99（5.56，8.08）a | 15.978 | <0.001 |
| 尿酸/（μmol/L） | 363.51±98.02 | 369.06±90.12 | 367.75±92.49 | 0.051 | 0.950 |
| 尿素氮/（mmol/L） | 5.05（4.34，5.88） | 5.58（4.59，7.09） | 6.10（5.03，7.59） | 14.014 | 0.001 |
| 血肌酐/（μmol/L） | 70.00（58.00，79.94） | 77.00（68.42，85.50） | 79.89（67.40，90.00） | 11.093 | 0.004 |
| 空腹血糖/（mmol/L） | 5.20（4.79，6.24） | 6.08（5.28，8.01） | 5.82（4.90，7.81） | 9.480 | 0.009 |
| 总胆固醇/（mmol/L） | 4.22（3.72，5.16） | 3.83（3.19，5.04） | 4.07（3.20，5.28） | 2.305 | 0.316 |
| 甘油三酯/（mmol/L） | 1.41（1.12，1.77） | 1.40（1.05，1.97） | 1.66（0.92，2.26） | 0.674 | 0.714 |
| LDL/（mmol/L） | 2.69（2.33，3.56） | 2.34（1.83，3.48） | 2.59（1.94，3.67） | 2.490 | 0.288 |
| HDL/（mmol/L） | 1.42（1.24，1.54） | 1.42（1.22，1.66） | 1.32（1.14，1.55） | 3.765 | 0.152 |
| GHbAlc/（mmol/L） | 6（3，9） | 7（6，9）a | 8（6，10）a | 8.144 | 0.016 |
| 脂蛋白/（mmol/L） | 77.00（32.00，153.00） | 115.50（31.25，278.50） | 119（48.25，260.75） | 2.933 | 0.231 |
| 收缩压/mmHg | 125（116，137） | 126（116，138） | 123（113，136） | 1.445 | 0.486 |
| 舒张压/mmHg | 79（73，86） | 80（4，85） | 75（70，83） | 7.636 | 0.022 |
注：与对照组比较，aP < 0.017。 |
二、对照组、轻度狭窄组、重度狭窄组血清Egr3、IL-6、TNF-α水平比较
重度狭窄组血清Egr3、IL-6、TNF-α水平高于对照组；重度狭窄组Egr3、IL-6水平高于轻度狭窄组，差异均有统计学意义（P均< 0.05）。见表2。
表2 对照组、轻度狭窄组、重度狭窄组的Egr3、IL-6、TNF-α表达水平比较（$\bar{x} \pm s$） |
| 指 标 | 对照组（47名） | 轻度狭窄组（66例） | 重度狭窄组（72例） | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| Egr3/（pg/mL） | 1 001.49±415.23 | 1 367.28±644.26ab | 2 167.54±1037.27a | 35.610 | <0.001 |
| IL-6/（pg/mL） | 27.06±16.31 | 41.33±18.06ab | 54.58±21.51a | 29.900 | <0.001 |
| TNF-α/（pg/mL） | 59.00±39.05 | 63.80±35.42b | 78.25±45.33a | 3.831 | 0.023 |
注：与对照组比较，aP < 0.05；与重度狭窄组比较，bP < 0.05。 |
三、Egr3与炎症指标、临床指标的相关性
Pearson相关分析结果显示，Egr3与Gensini评分（r=0.291，P < 0.01）、IL-6（r=0.574，P < 0.01）、TNF-α（r=0.228，P < 0.01）呈正相关。Gensini评分与IL-6（r=0.171，P < 0.05）呈正相关，与TNF-α（r=0.045，P > 0.05）无线性相关性。见图1A~E。
四、血清Egr3、IL-6、TNF-α水平对CHD的预测价值
讨论
Egr3在炎症反应中至关重要[13]。核因子-κB（NF-κB）对于CHD的炎症反应有重要作用。在CHD患者纤维化增厚的内膜/中膜病变的区域中，能检测到活化的NF-κB；在平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞发生炎性反应时存在NF-κB的激活[14]。Egr3通过参与NF-κB信号通路促进炎症反应[15]。抑制Egr3蛋白的激活可使炎症因子表达下调，减缓CHD发展[16]。因此，Egr3可能成为CHD治疗的一个新切入点。本研究结果显示，3组患者血清中Egr3水平存在明显差异，其中重度狭窄组患者血清中Egr3表达水平最高，而且Egr3与Gensini评分呈正相关。Li等[17]研究表明，Egr3基因多态性与CHD具有明显相关性。Egr3在CHD发展中起重要作用，对CHD患者的病情评估具有一定价值。Egr3作为一种响应促有丝分裂刺激而被诱导的立刻早期生长反应基因，可以在多种细胞中被诱导以响应刺激，包括压力、缺氧、损伤、细胞因子和生长因子等刺激[18-19]。目前研究中，主要关注Egr3在中枢神经系统发育、肌肉牵张受体功能、血管生成和癌症等方面的研究[20-21]。本研究结果提示，Egr3可能是未来临床判断CHD患者病情严重程度的一个重要生物标志物。
炎症反应是CHD发生和发展的驱动力，在CHD发病过程中能分泌大量炎症细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β、基质金属蛋白酶-9以及趋化因子（CC基序）配体2（CCL2），加剧血管炎症并降低斑块稳定性[22]。本研究中，重度狭窄组患者IL-6水平高于对照组和轻度狭窄组，重度狭窄组患者TNF-α水平高于对照组，IL-6与Gensini评分呈正相关，与前人研究结果一致。但是，目前尚未有临床研究证实有关Egr3、炎症细胞因子IL-6、TNF-α之间关联的机制，关于Egr3与炎症因子及CHD之间的相关性的前期研究仍然不足，本研究将对这一问题进行进一步探讨。
在细胞水平上，Yang等[23]将细胞经模拟体外炎性环境的脂多糖处理后，细胞中Egr3、TNF-α和IL-6水平上调，Egr3的过表达促进TNF-α、p65表达上调和NF-κB启动子活性增加。用IL-1β或TNF-α处理原代人视网膜内皮细胞分离物，Egr3 受TNF-α刺激后被靶向上调[24]。Egr3激活有助于炎症反应进行，Egr3下调减轻上皮细胞的炎症反应，以及降低了炎症环境刺激产生的IL-6、TNF-α蛋白质水平[25]。炎症细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β是Egr3的相关基因 ，其启动子中都富含Egr3结合位点[26]。本研究结果显示，IL-6、TNF-α水平与Egr3表达水平呈正相关。ROC曲线是用于评估预测指标准确性的重要方式，ROC曲线结果显示，Egr3、IL-6、TNF-α的AUC为0.769、0.784、0.565，灵敏度为74.6%、70.3%、93.5%，特异度为68.1%、74.5%、25.5%。Egr3作为预测CHD的检测指标具有较好的可行性，需扩大样本量进一步探讨。
综上所述，Egr3能作为判断CHD严重程度的指标，Egr3还与炎症指标IL-6、TNF-α具有明显相关性，临床中可通过检测Egr3水平判断CHD患者病情。检测Egr3指标有助于指导患者及早实施相应干预措施，对提示患者的诊治有较高的应用价值。本研究为横断面研究，并仍存在一些不足，需开展大样本量分析，并对出院患者进行随访。