肺癌是全球发病率和病死率最高的癌症[1-3]。作为非小细胞肺癌的主要类型，近年来肺腺癌的发病率增长迅速，已超过肺鳞癌，约占肺癌病例的40%[4-6]。尽管分子靶向治疗在肺腺癌的治疗中取得了显著进展，但全球范围内该病患者的5年生存率仍不足20%[7-9]。因此，亟须寻找新的高特异度和高灵敏度的生物标志物，以改善肺腺癌的诊断、预后及治疗策略。葡萄糖氨基转移酶3[glucosaminyl（N-acetyl）transferase 3，GCNT3]是一种黏蛋白型合酶，在聚糖合成中发挥重要作用。研究表明，GCNT3在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌和肝癌等多种癌症中具有关键作用，并与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相关[10-18]。GCNT3高表达可促进细胞的增殖、迁移和侵袭。然而，GCNT3在肺腺癌中的表达及其对癌细胞生物学行为的影响尚缺乏详细研究。本研究旨在探讨GCNT3基因对肺腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，为肺腺癌的诊断和治疗提供新的潜在生物标志物及分子靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
收集2020至2023年在本院行手术治疗的30例肺腺癌患者的癌组织及其对应的癌旁正常组织。纳入标准：经病理活组织检查（活检）确诊为肺腺癌，并有完整的临床和病理资料，癌旁正常组织取自距离肿瘤边缘至少2 cm处，确保样本无肿瘤细胞浸润。排除标准：非原发性肿瘤者，合并其他肿瘤者。30例肺腺癌患者中，男14例、女16例，患者年龄为42~65岁，中位年龄为53岁。所有患者均签署知情同意书，研究方案经医院伦理委员会批准[批件号：（2023）医伦第（018）号]。为避免交叉污染，采样过程严格控制。组织取材后，部分样本经4%多聚甲醛固定以保存组织结构，另一部分样本迅速置于液氮中冷冻保存，并转移至-80 ℃超低温保存。
1.2 主要试剂与仪器
H1650细胞株购自美国模式菌种收集中心，DMEM培养基、胎牛血清、1%青链霉素购自美国Gibco公司，短发夹RNA（short hairpin RNA，ShRNA）慢病毒质粒、TRIzol试剂、SYBR Green试剂盒和Transwell小室购自德国Sigma-Aldrich公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司；RT-qPCR引物购自上海生工生物工程有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法试剂盒和细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自上海碧云天生物技术公司。
1.3 细胞培养与转染
将H1650细胞调整至1×104 /mL，每组设3个复孔，置于含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2的条件下进行培养和传代。按照Lipofectamine 2000试剂操作说明，将100 nmol/L的GCNT3 ShRNA（靶序列：5'-GACCCAAAGGTAGATGATAAT-3'）转染入H1650细胞，并将细胞暴露于2 mg/L的嘌呤霉素溶液中筛选。转染后的细胞设为Sh GCNT3组，在含1 mg/L嘌呤霉素的培养基中持续培养72 h以维持稳定性。空白对照组即Sh NC组，使用Sh NC通过Lipofectamine 2000转染。
1.4 实时荧光定量PCR法检测GCNT3的mRNA表达水平
每组设3个复孔，使用TRIzol试剂提取样本总RNA，然后依据RT-qPCR试剂盒的操作说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增。GCNT3正向引物：5'-TCTGGGCTGCTATATGCTGC-3'，GCNT3反向引物：5'-GTTGATAGACCTCTTTGCTGGAA-3'；β-actin正向引物：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，β-actin反向引物：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。产物长度控制为163 bp，β-actin用作内参基因，作为内源性对照。GCNT3基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。
1.5 细胞计数试剂盒-8法检测细胞增殖
将Sh NC组与Sh GCNT3组H1650细胞以1×104 /mL接种于96孔培养板中，每组设3个复孔，分别在37 ℃、5% CO2条件下培养24、48、72 h。培养结束后，每孔加入10 µL CCK-8试剂，继续孵育2 h。以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）为空白对照。随后使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度（A）值。细胞增殖率=（A实验孔-A空白对照孔）/（A对照孔-A空白对照孔）×100%。
1.6 流式细胞仪检测H1650细胞凋亡
当Sh NC组与Sh GCNT3组H1650细胞融合度达70%~80%时，使用胰蛋白酶消化并用PBS洗涤，制备相应的细胞悬液。每份细胞悬液中加入5 µL Annexin V-FITC试剂，在避光条件下孵育15 min，然后加入5 µL PI（50 mg/L）染色10 min，并向每管加入400 µL结合缓冲液。最后，使用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。凋亡率为早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞百分率之和。每组设3个复孔。
1.7 Transwell法检测H1650细胞的侵袭能力
将Sh NC组与Sh GCNT3组H1650细胞调整至1.5×105 cells/mL，将基质胶与DMEM培养基按1∶5的比例在冰上混合制备。然后，使用移液枪将稀释后的基质胶缓慢均匀地铺于Transwell上室。接着，在Transwell上室内加入300 µL细胞悬液，而下室添加500 µL含10% FBS的DMEM培养基。细胞培养48 h后，固定并染色穿过Transwell膜的细胞，在显微镜下进行观察。
1.8 蛋白免疫印迹法检测上皮-间质转化相关蛋白的表达水平
收集各组细胞，使用PBS洗涤2次以去除上清液。随后，使用细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白，用BCA试剂盒进行定量。等量的蛋白质样品通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上。膜上用1%脱脂牛奶封闭1 h，然后用含0.1%吐温-20的PBS洗膜3次，每次10 min，接着将膜与相应的一抗在4 ℃摇床上孵育过夜，再用含0.1%吐温-20的PBS洗膜3次，每次10 min。随后，用结合辣根过氧化物酶的二抗孵育。使用ECL化学发光液进行曝光并拍照，以GAPDH作为内参。蛋白免疫印迹法结果使用ImageJ软件进行定量分析。
1.9 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析和图形数据表示，所有数据以$\bar{x}±s$表示，2组间比较采取Student-t检验。每项实验均重复进行3次，数据符合统计分析的假设。双侧P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 GCNT3在癌旁正常组织和肺腺癌组织中的表达情况
RT-qPCR法结果显示，癌旁正常组织中GCNT3 mRNA的表达量为1.00±0.23，而肺腺癌组织中GCNT3 mRNA的表达量为3.75±0.28，差异具有统计学意义（t = 41.57，P < 0.000 1）。见图1。
2.2 下调GCNT3对肺腺癌H1650细胞增殖水平的影响
CCK-8法检测结果显示，Sh NC组在24、48和72 h的增殖率分别为（57.64±3.96）%、（76.26±4.58）%和（92.24±5.12）%；Sh GCNT3组在相应时间点的增殖率分别为（42.32±3.72）%、（62.21±4.62）%和（73.31±4.86）%。组间的增殖率比较差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。
表1 下调GCNT3对肺腺癌H1650细胞增殖水平的影响Table 1 The effect of downregulating GCNT3 on the proliferation level of lung adenocarcinoma H1650 cells |
| 组 别 | n | 细胞增殖率/% | ||
|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 72 h | ||
| Sh NC组 | 3 | 57.64±3.96 | 76.26±4.58 | 92.24±5.12 |
| Sh GCNT3组 | 3 | 42.32±3.72 | 62.21±4.62 | 73.31±4.86 |
| t值 | -4.88 | -3.74 | -4.64 | |
| P值 | 0.008 | 0.020 | 0.010 | |
2.3 下调GCNT3对肺腺癌H1650细胞凋亡水平的影响
2.4 下调GCNT3对肺腺癌PC3细胞侵袭水平的影响
Transwell实验结果显示，2组侵袭细胞数分别为（25.12±2.30）个与（9.26±1.68）个，Sh GCNT3组细胞的侵袭能力低于Sh NC组，差异有统计学意义（t = -9.64，P < 0.001）。见图3。
2.5 下调GCNT3对肺腺癌PC3细胞上皮-间质转化表型的影响
蛋白免疫印迹法结果显示，与NC组（0.33±0.06）比较，Sh GCNT3组E-cadherin蛋白（0.85±0.07）表达水平增加，差异有统计学意义（t = 9.77，P < 0.001）；与NC组（0.72±0.06，0.72±0.05）比较，Sh GCNT3组Vimentin、N-cadherin蛋白（0.31±0.05，0.32±0.04）表达水平降低，差异均有统计学意义（t = -9.09，P < 0.001；t = -9.61，P < 0.001）。见图4。
3 讨论
根据近年的全球癌症统计数据，肺癌仍然是导致癌症相关死亡的首要原因，约占全球癌症死亡人数的18%[19-21]。在中国，肺癌也是癌症病死率最高的肿瘤类型，病死率达19%，这一趋势可能与吸烟年轻人群中肺癌发病率的增加密切相关[22-25]。尽管近年来手术、放射治疗、化学治疗及靶向治疗等治疗手段取得了显著进展，肺癌患者的整体预后依然不甚理想，特别是在具有转移、复发及治疗耐药性的患者中[26-30]。肺腺癌是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较多见于女性及抽烟者。其起源于支气管黏膜上皮，少数起源于大支气管的黏液腺，其预后优于其他类型的肺癌[31]。探讨肺腺癌放射治疗耐药的机制和潜在分子靶点，对更好地改善患者的生存预后具有重要意义[32]。
本研究首先通过RT-qPCR检测了30例肺腺癌及其癌旁正常组织中GCNT3的表达水平，结果显示肺腺癌组织中GCNT3表达高于癌旁正常组织，提示GCNT3可能与肺腺癌的发生密切相关。为进一步探究GCNT3在肺腺癌进展中的作用机制，本研究通过转染GCNT3 ShRNA构建了GCNT3敲低的H1650细胞株，评估了GCNT3的下调对肺腺癌相关恶性生物学行为的影响。结果表明，GCNT3的敲低抑制了H1650细胞的增殖，同时促进了细胞凋亡，这一过程进一步导致了细胞侵袭能力的降低。研究结果表明，GCNT3在调控细胞生长和生存中发挥着关键作用，可能通过影响细胞的生存和迁移机制，协调细胞增殖与凋亡的平衡。因此，GCNT3的表达可能是维持H1650细胞增殖与侵袭能力的重要因素。
EMT是一种细胞通过特定程序由上皮表型转化为间质表型的生物学过程，在肿瘤发展、创伤修复、胚胎发育及器官纤维化过程中具有重要作用[40-42]。EMT通常伴随着上皮细胞黏附分子E-cadherin表达的下调及间质标志物Vimentin的上调，目前被公认是推动肺腺癌转移的重要机制[43-45]。大部分肿瘤细胞中的E-Cadherin的表达是下调的，而N-Cadherin的表达增加[46]。本研究进一步通过蛋白免疫印迹法发现，敲低GCNT3表达水平能够抑制H1650细胞E-cadherin表达的下调、间质标志物Vimentin的上调，而N-Cadherin的表达增加，这表明GCNT3可能通过调控EMT过程促进肺腺癌的侵袭和转移。
综上所述，本研究证实了GCNT3在肺腺癌中的高表达，并通过调控H1650细胞的增殖、侵袭、凋亡及EMT过程，表明GCNT3在肺腺癌的发生、发展中起到至关重要的作用。GCNT3有望作为肺腺癌诊断和治疗的潜在靶点，尤其是在阻止肺腺癌转移方面具有重要的应用前景。
利益冲突声明：本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。